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Bonnes pratiques
Quelles sont les informations essentielles à vérifier
pour s’assurer de la spécificité d’un anticorps ?

Processus de validation d'un anticorps
L’idéal est d’acheter des anticorps avec toutes les validations directement réalisées par le fabriquant lors du développement de celui-ci et lors du QC de production de chaque lot.
Comme décrit plus loin, les types de validation permettent de s’assurer de la spécificité d’un anticorps, la spécificité étant liée à de nombreux critères :
  • la sensibilité
  • les applications testées et validées
  • les espèces testées et les tests de spécificité eux-mêmes
  • et n’oublions pas le protocole utilisé …

Quelles sont les caractéristiques et validations à vérifier ?

Tout d’abord, commencez par consulter et étudier la fiche technique de l’anticorps acheté.

 

La sensibilité

Pour le Western Blot (WB) par exemple, choisissez des anticorps qui reconnaissent un niveau de protéine endogène. Ceci est indiqué sur la fiche technique et sinon regardez l’image du WB montré en exemple dans cette fiche. Si un blot très propre est montré avec une protéine recombinante, purifiée et déposée sur gel, ça ne signifie ni que cet anticorps a une affinité suffisante pour détecter le niveau endogène de la protéine dans une cellule ou un tissu, ni qu’il est spécifique puisque que la protéine déposée a été préalablement purifiée.

Peut-être qu’en conditions réelles, cet anticorps reconnait également de nombreuses protéines de la même famille ayant un motif en commun !
De même si c’est une cellule transfectée surproduisant la protéine, ça ne prouve rien sur la capacité de cet anticorps à détecter un niveau de protéine endogène.

Il faut voir une bande propre et unique pour une lignée classique de votre espèce qui ne surproduit pas la protéine, mais parfois un traitement spécifique est nécessaire comme dans le cas par exemple de protéines phosphorylées, acétylées, clivées, etc …
Comment arrive-t-on à obtenir un marquage avec une bande unique et propre ? Il faut que le peptide antigénique ait été conçu par bio-informatique pour générer des anticorps spécifiques (choix de séquences non homologues au reste du génome étudié). Selon la stratégie choisie, soit de produire un polyclonal ou un monoclonal, on pourra générer plusieurs épitopes sur un même peptide antigénique.
Un peptide de 50 à 150 acides aminés pourra, s’il est injecté à un lapin, permettre de générer 3 à 5 épitopes antigéniques différents pour produire un anticorps polyclonal.

Ne choisissez pas des anticorps qui ont été développés en immunisant un animal avec une protéine entière. Par définition, cet anticorps polyclonal ne sera pas spécifique car compte tenu des homologies de séquences dans un génome, statistiquement cet anticorps reconnaitra un trop large panel de protéines totalement différentes de ce que vous recherchez.

 

La spécificité

Renseignez-vous auprès du fabricant de l’anticorps pour connaitre les techniques utilisées pour valider la spécificité.

La spécificité se vérifie en éteignant le signal par une approche spécifique utilisant :

  • un siRNA pour éteindre l’expression de votre protéine (sur cellules)
  • une lignée KO dans laquelle la bande spécifique doit disparaitre en WB
  • un peptide bloquant (peptide antigénique) bloque le site de reconnaissance de l’anticorps et met en évidence une détection et un signal aspécifique assimilables à du bruit de fond.

Mais parfois ces données ne sont pas disponibles, si on travaille sur des tissus humains par exemple. On devra donc faire référence à d’autres informations collectées dans les bases de données ou croiser avec des informations venant d’autres techniques de biologie qui n’utilisent pas d’anticorps par exemple. On peut corréler une expression dans un tissu humain avec le niveau d’ARNm du gène codant pour sa protéine d’intérêt en RNA seq (Human Protein Atlas ).

Les bases de données pourront sur des espèces fréquemment étudiées vous préciser la localisation « habituelle » et attendue de votre protéine d’intérêt dans la cellule en IF, vous aurez aussi accès au niveau d’expression dans différents tissus (Human Protein Atlas ).

Si vous obtenez en WB des bandes de taille non-attendue, ça n’est pas forcément un problème de spécificité. Sachez que beaucoup de protéines existent sous différentes isoformes en raison des épissages alternatifs. Consultez les bases de données (ex : Swissprot ) pour savoir si votre protéine d’intérêt est concernée.
Si votre anticorps primaire reconnait un épitope présent dans les différentes isoformes, vous pouvez voir apparaitre des bandes multiples sur votre membrane. Cette information n’est pas toujours indiquée sur la fiche technique. En effet certaines isoformes sont tissus-spécifiques et ne sont pas toujours présentes dans les lignées cellulaires dont les lysats sont présentés sur les fiches techniques.
Il y a aussi des anticorps dont l’épitope n’est présent que dans une isoforme unique, qui peut ne pas être exprimé dans votre tissu ou votre lignée.
Renseignez-vous sur la séquence précise de l’épitope ayant servi à générer l’anticorps et comparez-la avec les données sur les isoformes publiées dans les bases de données.

Si vous n’avez pas de données sur ce qui a été fait, il est préférable de vérifier par vous-même la spécificité avec un contrôle siRNA ou une lignée KO (CRISPR par exemple). En cytométrie de flux, en IHC et en IF, on peut aussi utiliser un isotype contrôle. Cela permet de vérifier la fixation aspécifique d’un anticorps. En effet, il y de nombreux artefacts liées à la méthode de détection et non à l’anticorps lui-même, ni à sa propre spécificité.

 

Les applications testées

N’extrapolez-pas les données de validation indiquées sur la fiche technique à une application ou une espèce non testées, fiez-vous aux données validées dans la fiche technique.

Si un anticorps marche en WB ou en IF, rien ne prédit qu’il fonctionne en IHC ou en IP. Pourquoi ?
D’une technique à l’autre, les protéines ne sont pas dans la même conformation. Elles peuvent être dans un état :

  • dénaturé en WB (structure primaire linéaire = séquence en acides aminés),
  • natif légèrement fixé (structure tertiaire) en IF
  • « natif modifié » en IHC (dû au pontage du fixateur suivi par un démasquage, ce qui n’est pas du tout équivalent à l’IF)

Cela explique qu’un même anticorps fixe différemment ou pas un même épitope selon la conformation de la protéine. En effet, les épitopes reconnus peuvent être de plusieurs types sur une protéine native. Un anticorps peut reconnaitre soit un épitope linéaire séquentiel sur une boucle de la protéine (identique à la structure primaire) ou un épitope discontinu non séquentiel (correspondant à une structure dépendant de la conformation).

Donc si un anticorps est spécifique dans une application donnée, il peut néanmoins reconnaitre n’importe quelle autre séquence/épitope dans une autre et générer un bruit de fond. On dit souvent de choisir en IF et en IHC des anticorps qui donnent une belle bande unique en WB, c’est vrai, c’est un indice, mais cela n’est pas suffisant.

De plus dans ce cas, vous excluez de votre sélection tous les « bons anticorps » qui reconnaissent une structure 3D différente de la séquence linéaire en acides aminés mais qui ne fonctionnent pas en WB. Vous comprendrez qu’il vous faut donc disposer de contrôles adéquats de la spécificité pour une application donnée. On ne peut pas transposer.

Vous pouvez avoir un anticorps qui génère une belle bande en WB mais qui donne un marquage aspécifique en IF.
Pourquoi ? 
Si dans la cellule, l’anticorps spécifique de votre protéine-cible reconnait également une autre protéine car sa structure 3D rapproche des résidus non successifs (épitope discontinu) et mime l’épitope linéaire de votre protéine-cible, alors cet anticorps donnera un marquage aspécifique en IF. Ce type d’homologie d’épitopes est imprévisible en analysant par bio-informatique les homologies des séquences primaires d’un génome lors du design des peptides antigéniques. On peut avoir le même type d’homologie entre la structures 3D de 2 protéines totalement différentes (en termes de séquence linéaire) si ce sont des épitopes de conformation. C’est donc très complexe. C’est pour cette raison que rien ne vaut une validation pour chaque application par le fabricant de l’anticorps.

Lorsqu’un anticorps n’est pas validé dans une application, tout d’abord renseignez-vous auprès du fabricant pour savoir si celui-ci a réalisé des tests. Dans le cas où les résultats obtenus pour cette application sont négatifs, choisissez un autre anticorps. Si votre application n’a pas été testée, libre à vous de faire ces tests.

Dans l’idéal, on aimerait tous pouvoir trouver un anticorps validé pour toutes ses applications. Les nouvelles générations d’anticorps monoclonaux recombinants sont de bons candidats car la technologie utilisée pour les développer permet plus facilement de sélectionner de nombreux clones et donc de conserver ceux qui fonctionnent dans le maximum d’applications avec un très haut niveau de sensibilité et spécificité.


Les espèces

Si vous travaillez sur une espèce dite « exotique » pour laquelle les validations ne sont pas réalisées en standard par la majorité des fabricants : poisson-zèbre, bovin, drosophile, huitre, oursin … Il est recommandé d’obtenir ces informations sur la spécificité, sensibilité … absentes des fiches techniques.

Les anticorps ciblant une protéine dans une espèce donnée peuvent souvent être utilisés dans d’autres espèces si l’anticorps reconnait un épitope avec une homologie importante (> 85%). Cependant la taille de la protéine peut varier entre les espèces et donner une bande de taille inattendue en WB.
Demandez-nous toujours avant de tester un anticorps dans une espèce non validée par le fabricant un alignement de séquence entre l’épitope et la séquence homologue de votre espèce d’intérêt. Si l’homologie est forte, il y a de grandes chances que cet anticorps fonctionne sur vos échantillons. Mais il est recommandé de vérifier la spécificité avec un contrôle siRNA ou une lignée KO (CRISPR par exemple). Et surtout ayez en mémoire que l’homologie globale entre génome ou sur la protéine totale ne vous garantit pas un signal spécifique. Malheureusement, certains fournisseurs ne donnent qu’une zone imprécise de quelques centaines d’acides aminés, et non la séquence précise de l’épitope antigénique.


La spécificité dépend aussi du niveau de purification de l’anticorps

Un surnageant de culture ou un liquide d’ascite contient beaucoup d’autres protéines et   molécules en plus de votre anticorps qui peuvent plus ou moins interagir et générer un bruit de fond.
Un anticorps purifié peut avoir été purifié par différentes méthodes :

  • par protéine A ou G, on sélectionne une espèce d’immunoglobuline, IgG par exemple
  • ou par affinité : avec le peptide antigénique, on sélectionne de manière spécifique les anticorps reconnaissant l’antigène

Si votre anticorps est monoclonal et purifié par affinité, il ne contient qu’une seule espèce d’immunoglobuline ciblant l’antigène. C’est un gage de spécificité par rapport à un anticorps purifié par protéine A ou G contenant l’intégralité des IgG (par exemple) contenues dans le sérum d’un animal et donc aussi des anticorps dirigés contre des pathogènes présents dans l’environnement de l’animal immunisé.

Gardez aussi en mémoire que tout cela est fiable si et seulement si votre anticorps n’est pas périmé, s’il a été correctement conservé, si le protocole optimal du fabricant a été respecté et si vous avez utilisé les bons contrôles.

Retrouvez ces recommandations en images (Réalisées par notre partenaire Bethyl Laboratories)

Le Service Technique Ozyme est à votre écoute pour vous apporter les réponses à vos questions et vous aider sur le choix de vos anticorps.


Bases de données utiles


Vidéos


FAQ de Cell Signaling Technology sur la validation en vidéos