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Bonnes pratiques pour contrôler la quantité et la pureté des acides nucléiques

NanoDrop™, Qubit, pureté, quantification, qualité d’ADN ou d’ARN
La PCR, la qPCR, la transcription inverse (RT) ou le séquençage de nouvelle génération (NGS) sont parfois délicats à mettre en œuvre et exigent que la qualité des acides nucléiques soit contrôlée au préalable pour garantir la fiabilité et la précision des résultats.
Quelles sont les méthodes recommandées pour réaliser ce contrôle de qualité des acides nucléiques ? Découvrez-les dans cette revue « les bonnes pratiques ».

Quelles sont les méthodes recommandées pour la quantification ?

Deux méthodes sont couramment utilisées :
  • La spectrométrie basée sur la mesure de l’absorbance des acides nucléiques dans l’UV
  • La fluorométrie basée sur la mesure de la fluorescence des fluorophores spécifiques des acides nucléiques

Le spectrophotomètre permet de mesurer les absorbances dans l'UV et l’appareil le plus utilisé est le NanoDrop™. Cet appareil a l’avantage d’utiliser seulement 1 µL d’échantillon sans avoir besoin d’utiliser de réactif ou de solution supplémentaires pour les mesures. La gamme dynamique de la quantification sur le NanoDrop™ est large allant de 0,2 ng/µL à 27 500 ng/µL pour un ADN double brin.

L’appareil le plus utilisé permettant de quantifier les acides nucléiques par la fluorescence est le Qubit®. La limite de détection du Qubit® est relativement faible, de l’ordre du pg/µL. De plus, il est possible de quantifier sélectivement les ADN ou les ARN dans un même mélange. Mais des réactifs et standards dédiés sont nécessaires pour réaliser ces mesures sur le Qubit® et la gamme dynamique de la quantification est plus restreinte que celle de NanoDrop™.

 

Pourquoi et comment mesurer la pureté ?

Même après une purification, les ADN ou les ARN peuvent encore contenir des contaminants. Certains contaminants impactent significativement les applications de biologie moléculaire et sont responsables d’analyses erronées, de résultats incohérents ou non reproductibles … Il est alors important de contrôler systématiquement la pureté des acides nucléiques en amont de toute application pour identifier les contaminants. La spectrophotométrie est la seule méthode qui permette de vérifier la pureté d’un acide nucléique grâce aux deux ratios A260 nm/A280 nm et A260 nm/A230 nm. Pour en savoir plus sur comment contrôler la pureté des acides nucléiques avec le NanoDrop™, lire ce TechOzyme.

Si vous souhaitez optimiser la pureté des acides nucléiques, découvrez nos conseils dans ce TechOzyme.


Comment le NanoDrop™-ONE peut-il garantir la précision et la fiabilité de la quantification ?

Les contaminants peuvent aussi impacter les absorbances à 260 nm et la quantité des acides nucléiques peut être sur- ou sous-estimée. La technologie « Sample Intelligence Acclaro™ » de l’appareil NanoDrop™-ONE  permet d’identifier les contaminants les plus courants comme les protéines, le phénol ou la guanidine et de corriger les absorbances. Les concentrations des acides nucléiques mesurées par le NanoDrop™-ONE sont alors plus précises et fiables.
En savoir plus sur la technologie Acclaro™


Comment choisir la ou les méthodes de contrôle de qualité adaptées ?

Si la quantité des acides nucléiques dans les échantillons est estimée à plus de 20 ng/µL et si la DNase ou la RNase sont utilisées pendant les purifications, nous conseillons le NanoDrop™-One. Car il permet simultanément de :
  • Quantifier les acides nucléiques avec une grande précision
  • Contrôler la pureté
  • Identifier les contaminants courants
Le Qubit® est également adapté, mais il est recommandé de contrôler la qualité des acides nucléiques avec le NanoDrop™-ONE.

Si les acides nucléiques sont en faible quantité de l’ordre de pg/µL, le Qubit® est plus approprié. Actuellement aucune méthode ne permet de contrôler la qualité des acides nucléiques en très faible quantité.

Enfin, pour certaines applications comme le RACE, la construction de banque d’ADNc, le séquençage PACBio … l’intégrité des acides nucléiques doit être contrôlée en parallèle de la quantité et la pureté. Pour ce faire, nous recommandons le Bioanalyzer ou à défaut le gel d’électrophorèse.