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Questions / Réponses de WB

Pourquoi avec mon anticorps, je vois des bandes « propres » mais pas à la taille attendue ?

Voici quelques hypothèses que vous devez vérifier :


Est-ce que votre protéine d’intérêt présente différentes isoformes ?

Beaucoup de protéines existent sous différentes isoformes à cause des épissages alternatifs. Consultez les bases de données (ex : Swissprot) pour savoir si votre protéine d’intérêt est concernée.
Si votre anticorps primaire reconnait une épitope présente dans les différentes isoformes, vous pouvez voir apparaitre des bandes multiples sur votre membrane. Cette information n’est pas toujours indiquée sur la fiche technique. En effet certaines isoformes sont tissus-spécifiques et ne sont pas toujours présentes dans les lignées cellulaires dont les lysats sont présentés sur les fiches techniques.
Il y a aussi des anticorps dont l’épitope n’est présente que dans une isoforme unique, qui peut ne pas être exprimée dans votre tissu ou votre lignée.
Renseignez-vous sur la séquence précise de l’épitope ayant servi à générer votre anticorps et comparez la avec les données sur les isoformes publiées dans les bases de données.


Est-ce que sa taille peut être différente dans une autre espèce ?

Les anticorps ciblant une protéine dans une espèce donnée peuvent souvent être utilisés dans d’autres espèces si l’anticorps reconnait une épitope avec une homologie importante (>85%). Cependant la taille de la protéine peut varier entre les espèces et donc donner une bande de taille inattendue.
Demandez-nous toujours avant de tester un anticorps dans une espèce non validée par le fabricant un alignement de séquence entre l’épitope et la séquence homologue de votre espèce d’intérêt. Si l’homologie est forte, il y a de grandes chances que cet anticorps fonctionne sur vos échantillons. Mais dans ce cas, il est préférable de vérifier la spécificité avec un contrôle si RNA ou une lignée KO (CRISPR par exemple). 


Est-ce qu’elle a pu subir une dégradation par des protéases ?

Les protéases peuvent digérer votre protéine-cible pendant la préparation de l’échantillon ou le stockage. Si vous avez un doute (notamment lors de l’obtention d’un « smear » sur votre blot en dessous de la taille attendue), n’hésitez pas, re-testez avec un lysat fraichement préparé avec suffisamment d’inhibiteurs de protéases, en ayant vérifié préalablement la date de leur péremption.


Est-ce qu’elle a pu subir des modifications post-traductionnelles ou un process protéolytique (précurseur) ?

Les protéines sont soumises à des modifications post-traductionnelles variées comme l’acétylation, la phosphorylation, ou la glycosylation et peuvent donc exister avec des tailles différentes selon l’état de la cellule. Certaines protéines (par exemple caspases ou insuline) sont synthétisées sous forme d’un grand précurseur contenant plusieurs protéines et est clivé en une forme active de la protéine par des protéases de la cellule. Se référer également aux bases de données pour connaitre l’existence et la taille attendue de ces protéines modifiées ou de ces précurseurs quand vous obtenez des bandes à une taille supérieure à la taille attendue. Vous pouvez parfois obtenir une multitude de bandes si l’anticorps reconnait toutes les formes de la protéine-cible.

 

Retrouvez-nous le mois prochain avec une autre question WB.
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