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Questions / Réponses de WB

Pourquoi avec mon anticorps, je ne vois aucune bande ?

Voici quelques hypothèses que vous devez vérifier :


Est-ce que mes anticorps primaire et secondaire sont compatibles ?

Vérifiez sur vos fiches techniques que votre secondaire reconnait bien l’espèce source du primaire ainsi que son isotype.

Est-ce que mon anticorps primaire reconnait bien ma protéine cible sous sa forme dénaturée ?

Il faut absolument utiliser un anticorps validé pour le WB, c'est-à-dire capable de reconnaitre l’épitope sous sa forme dénaturée. Si votre anticorps ne reconnait que la forme native de la protéine et qu’il est uniquement validé en cytométrie ou en IF par exemple, c’est qu’il a besoin de la structure 3D pour reconnaitre l’épitope. Quand une application courante comme le WB ne figure pas sur la fiche technique, cela signifie dans la grande majorité des cas qu’il ne fonctionne pas sur une protéine dénaturée.
En cas de doute, ne perdez pas votre temps à tester vous-même une application non renseignée ou non validée par le fabricant, demandez-nous si l’application a été testée et quels ont été les résultats obtenus.

Est-ce que mon primaire reconnait bien ma protéine cible dans mon espèce d’intérêt ?

 Les anticorps ciblant une protéine dans une espèce donnée peuvent souvent être utilisés dans d’autres espèces si l’anticorps reconnait une épitope avec une homologie importante entre les espèces (>85%).
Demandez-nous toujours avant de tester un anticorps dans une espèce non validée sur la fiche technique un alignement de séquence entre l’épitope et la séquence homologue de votre espèce d’intérêt. Si l’homologie est forte, il y a de grande chance que cet anticorps fonctionne sur vos échantillons. Mais dans ce cas, il est préférable de vérifier la spécificité avec un contrôle négatif siRNA (qui pourra éteindre tout ou partie de l’expression et donc faire disparaitre la bande) ou une lignée KO (CRISPR par exemple), qui permettra d’avoir une lignée délétée pour ce gène qui n’exprime pas du tout la protéine cible (pas de bande visible).

Ma protéine n’est pas reconnue par mon primaire, est-ce un problème d’accessibilité de l’épitope ?

Il est probable que l’épitope ne soit pas reconnu par l’anticorps dans vos échantillons, qu’il soit inaccessible à l’anticorps ; on recommande alors de soniquer vos échantillons.
La sonication est particulièrement importante pour les facteurs de transcription et les protéines nucléaires associées à la chromatine, puisqu'elle fractionne l'ADN et les membranes. Soniquer vos échantillons génère une préparation de lysat plus homogène et permettra plus facilement de comparer vos résultats entre échantillons. La sonication est la technique d'extraction de protéines la plus efficace. Elle rend les échantillons moins visqueux. Cell Signaling Technology recommande 3 pulses de 10 secondes à 35-40% de puissance (ou environ 15 W) avec un sonicateur à sonde (paramètres à ajuster selon le sonicateur). Et, préconise une pause de 10 secondes dans la glace entre chaque pulse.

Si vous n'avez pas accès à un sonicateur au laboratoire, vous pouvez faire passer vos échantillons à travers l’aiguille fine d’une seringue.

Même si n’êtes pas confrontés à ce type de problème, cette étape de sonication n'est pas superflue; gardez à l’esprit, que diminuer la viscosité de votre échantillon améliore notablement la facilité à pipeter l'échantillon lors du dépôt sur gel et optimise l’accessibilité de l’épitope. Vous aurez ainsi moins de mal à normaliser vos dépôts suite à un dosage de protéines totales, vous réduirez sensiblement les erreurs de pipetage.

Ma protéine a-t-elle été bien transférée?

Cell Signaling Technology a montré que les transferts secs ou semi-secs ne sont pas les plus efficaces. Si possible, il est recommandé d’utiliser un transfert liquide dans un appareil où les blots sont complètement immergés dans le tampon de transfert. Le protocole recommandé est un transfert à une intensité de 250 mA ou un voltage de 70 V pendant 2 h dans le tampon classique Tris-Glycine suivant : 25 mM Tris base (pH ajusté à 8.5), 0.2 M glycine, 20% méthanol.

Attention, on cherche souvent à remplacer le méthanol qui est toxique par de l’éthanol ; mais l’éthanol n’a pas une efficacité identique au méthanol pour le transfert.

Dans le cas d’une petite protéine (15-20 kDa), il y a un risque que l’étape de transfert soit trop efficace et que la protéine passe à travers la membrane si on utilise une membrane dont la taille des pores est de 0,45 µm. Dans ce cas, passer à une membrane de 0,2 µm. Vous pouvez tester cette hypothèse en superposant 2 membranes de 0,45 µm. Si vous détectez votre protéine sur la seconde membrane, c’est qu’elle était passée à travers la première. Il faut impérativement utiliser une membrane dont les pores sont de 0,2 µm.


Dans le cas de protéines de plus de 200 kDa, on utilise des gels Tris-Acétate 3-8 % avec un tampon de migration Tris-Acétate-SDS à pH neutre. Cela permet d’avoir une meilleure résolution et une détermination de poids moléculaire plus précise vers 500 kDa comparé à un système Tris-Glycine. En complément, on recommande un transfert d’au moins 2 à 3 heures avec 10 % de méthanol dans le tampon de transfert au lieu des 20 % habituellement utilisés. Cela augmente l’efficacité de transfert des grosses protéines.

Ma préparation d’échantillon permet-elle de conserver l’état de phosphorylation de ma protéine cible ?

Si on n’arrive pas à détecter sa protéine cible phosphorylée sur un échantillon conservé congelé quelques semaines alors qu’elle est détectable sur un même échantillon frais ; il faut alors vérifier avec un anticorps anti-protéine totale que la protéine non phosphorylée est bien présente. Ensuite, on vérifiera que les inhibiteurs de protéase et phosphatases conseillés ont bien été ajoutés. La phosphorylation étant très labile, il est recommandé de conserver ce type d’extrait à -80°C et non à -20°C, et de les utiliser le plus rapidement possible.

Ma protéine est-elle présente à l’état phosphorylé en quantité détectable dans mes lysats ?

D’une manière générale, il peut être intéressant de vérifier qu’on a déposé suffisamment de lysat en réalisant une gamme de dépôt. On dépose habituellement 20-30 µg / puits de protéines totales pour des extraits cellulaires et 80 à 100 µg pour des extraits de tissus. On fera au préalable un dosage de protéines par une technique type Bradford.
Tout d’abord, Il faudra vérifier que la forme phosphorylée est bien détectée par son anticorps en utilisant un traitement chimique ou des conditions de culture  capables d’induire fortement la phosphorylation de la protéine cible dans des cellules de lignées classiques ; ce lysat servira de contrôle positif. On vérifiera également que la protéine non phosphorylée est détectée en quantité normale.

Dans ce cas, il peut être intéressant d’enrichir l’échantillon en protéine cible par immuno-précipitation (IP). Par exemple pour l’étude d’une protéine phosphorylée présente en quantité très faible même après induction, on pourra au préalable immuno-précipiter la protéine cible avec un anticorps anti-forme totale.

Il est important de noter que certaines protéines sont présentes à l’état phosphorylé de manière transitoire et par conséquent il est assez difficile de prélever son échantillon de cellules au bon moment après l’étape d’induction. Testez plusieurs prélèvements à des temps différents de post-induction.

 

 

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