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Questions / Réponses de WB

Comment remédier à un bruit de fond important en Western Blot ?

Envisageons ensemble tous les cas de figure et leur solution.

Votre membrane :


Présente-elle des spots tout blancs ?

Dans le cas de régions ou spots tout blancs, ce n’est pas un bruit de fond mais l’inverse : une zone de non-marquage. Ce sont des bulles formées lors du transfert entre le gel/la membrane et les papiers buvards qui ont créées des zones ou le courant n’est pas passé. Cela peut aussi correspondre à une zone non mouillée lors du transfert.
Pour y remédier trempez chaque élément du sandwich (sauf les feuilles déjà vendues pré imbibées avant de l’empiler et chassez les bulles en roulant sur le sandwich une pipette ou un rouleau prévu à cet effet.

Est-elle toute noire ?

Soit votre étape de blocage n’est pas du tout efficace, soit votre tampon de blocage est contaminé.
Recommencez avec un tampon de blocage frais ; soit la révélation avec l’ECL a posé un problème : incubation trop longue ou exposition trop longue ; soit vous déposez trop de protéines ou vous utilisez trop d’anticorps.
Recommencez et suivez les recommandations de dilution de votre anticorps et le protocole.

Est-elle noire seulement sur une partie ?

Votre membrane n’a peut-être pas bien été uniformément immergée tout au long du protocole, elle a peut-être séchée dans une zone. Assurez-vous d’utiliser à chaque étape assez de volume de tampon sous agitation pour garantir une immersion continue et uniforme de la membrane.

Présente-t-elle de petites taches noires ?

Soit ces taches sont en bord de membrane et sont probablement dues à une pince contaminée, soit à des  petits morceaux de gels d’acrylamide qui sont restés collés à la membrane lors du transfert (souvent du « stacking gel » mal découpé avant le transfert).
Si ces tâches sont réparties sur toute la membrane comme de la « neige », vous avez peut être utilisé un tampon de blocage concernant du lait mal dissous qui donne un précipité se fixant à votre membrane.
Vérifiez aussi la propreté des boites dans lesquelles vous incubez les membranes.

 

Présente-t-elle des bandes blanches sur fond noir (révélation en négatif)?

Soit vous avez trop de protéines chargées sur le gel, essayez en faisant une dilution en série de trouver la quantité optimale à charger ; ou bien vous avez utilisé trop d’anticorps, augmentez la dilution utilisée.

Présente-t-elle un bruit de fond classique, comme un fond gris sous vos bandes noires ?

La concentration de l’anticorps primaire est trop élevée ou les conditions d’incubation ne sont pas optimales

 Un excès d’anticorps primaire engendre une hausse du bruit de fond. Pour éviter cela suivez les recommandations de dilution de la fiche technique fournie avec l’anticorps. D’autre part, une incubation longue à basse température donne de meilleurs résultats en termes de spécificité d’anticorps.
L’incubation du primaire la nuit à +4°C est fortement recommandé par rapport à une incubation pendant 1 heure à 37°C.

Blocage et lavage sont insuffisants

Si l’étape de blocage est insuffisante, les espaces non occupés sur la membrane vont générer du bruit de fond  après incubation des anticorps. Il faut également que le lavage soit suffisant (idéalement  3 x 5 min, ne pas tomber dans l’excès inverse qui risque de décrocher les anticorps). Pour bloquer, ni trop ni trop peu il faut utiliser un agent bloquant adapté.

Les agents bloquants sont en général en WB ; la caséine (protéine purifiée du lait), le lait en poudre écrémé du commerce ou la BSA purifiée. On les utilise en TBS-Tween ou PBS-Tween à un pourcentage de 2 à 5%.
De nombreuses rumeurs ou croyances circulent sur les agents bloquants. Il est souvent dit qu’il ne faut pas utiliser le lait l’étude des protéines phosphorylées car la caséine est une protéine phosphorylée qui risquerait de générer du bruit de fond en fixant les anticorps anti-forme « phospho ». On dit aussi que les protéines en extrait brut peuvent contenir des phosphatases qui risquent de déphosphoryler ces protéines phosphorylées.
Cependant Cell Signaling Technology préconise du TBT-Tween + 5% lait (#9999), ils n’observent pas de bruit de fond  ou de réactivité croisée avec les protéines du lait (y compris la caséine). Par rapport à l’activité phosphatase, la pasteurisation permet de détruire toute activité phosphatase dans le lait.
En effet, le lait est un meilleur agent bloquant que la BSA.
Sur le marché, il existe aussi des tampons de blocage dont la composition n’est pas communiquée.

Choix du tampon : TBS-Tween ou PBS-Tween ?

 Le TBST-Tween est recommandé comme tampon lors des lavages/incubations car le phosphate du PBS-Tween peut interférer si vous étudiez des protéines phosphorylées.
Par contre le PBS est préféré en cytométrie de flux et en IF car dans ces protocoles la fixation fait que les macromolécules sont cross-linkées avec des aldéhydes, et les amines primaires du Tris contenu dans le TBS peuvent interférer.

 

 

 

Retrouvez-nous le mois prochain avec une autre question WB.
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