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Questions / Réponses de WB

Contrôles de dépôt et normalisation
Comment optimiser ses conditions de Western Blot pour pouvoir quantifier ?



Pourquoi utiliser un contrôle de dépôt ?

Les contrôles de dépôt sur gel sont utilisés pour confirmer que la quantité de protéines déposée est identique sur l’ensemble des pistes du gel, permettant de normaliser le niveau de protéines détectées. On doit au préalable réaliser un dosage de protéines totales sur ses échantillons et déposer une quantité de protéines totales identiques sur les pistes du gel pour être comparées (entre 10 et 100 µg de protéines totales selon la nature de l’échantillon : cellules ou tissus).

Certains normalisent par rapport au nombre de cellules déposées mais ce n’est pas très précis car il est difficile d’estimer des changements selon la prolifération cellulaire et mort cellulaire. Ces estimations ne prennent pas en compte les variations de densité des cellules utilisées pour ensemencer, ni le volume final de lysat obtenu qui peuvent affecter la quantité totale de protéines. Des échantillons préparés à partir de la quantité totale de protéines cellulaires partent du principe que le contenu moyen en protéines de la cellule est constant à travers les différentes conditions étudiées.

Pour normaliser à l’aide du contrôle de dépôt, on part donc du principe que son abondance est constante dans les différentes conditions étudiées et que l’intensité des bandes reflète de manière linéaire l’abondance de la protéine.
Il est difficile d’affirmer qu’un seul contrôle remplisse ces deux conditions, on devrait idéalement normaliser par rapport à deux gènes de ménage différents pour atténuer ces variations. Mais en pratique, on utilise habituellement qu’un seul gène de ménage.

Une autre stratégie est de normaliser à l’aide de toutes les protéines présentes dans le gel.

Comment choisir le contrôle de dépôt adapté à son échantillon ?

Généralement, on choisit des protéines fortement exprimées de manière constitutive dans la lignée cellulaire ou dans l’échantillon étudié. Les protéines exprimées par des gènes de ménage  (GAPDH, tubuline,…) sont souvent choisies pour cette raison. Mais pour ce faire,  le niveau d’expression de la protéine contrôle ne doit pas varier entre les différents types d’échantillons étudiés et déposés sur un même gel. C’est essentiel pour la fiabilité et l’interprétation des résultats de vos Western blots. Il faut donc choisir une protéine dont on est absolument sûr que l’expression n’est pas modifiée en fonction des traitements ou des conditions (par exemple induction par une drogue) et des types d’échantillons.

Il faut aussi adapter sa technique de préparation des échantillons. Si par exemple, vous prenez une protéine contrôle entièrement ou partiellement localisée dans le noyau, prévoyez un tampon de lyse assez efficace pour extraire et solubiliser l’intégralité des protéines nucléaires (par exemple : l’extraction/solubilisation de l’histone H3, la HDAC1 Histone déacetylase 1 et la cyclophiline B (PPIB) est incompatible avec une lyse au tampon NP-40 qui extrait uniquement les protéines cytosoliques et membranaires).

Il faut également choisir une protéine de poids moléculaire différent de celui de sa protéine d’intérêt pour pouvoir distinguer les bandes (se reporter au tableau 2 ci-dessous). Il faut adapter le pourcentage de gel choisi pour la migration pour que toutes les bandes soient bien séparées (protéine d’intérêt et gène de ménage).

Il existe des anticorps primaires non couplés à utiliser en contrôle de dépôt, mais aussi des versions directement couplées à l’enzyme HRP permettant de gagner une étape. On perd une étape d’amplification par l’ajout d’un secondaire, mais cette étape est souvent inutile vu le niveau élevé d’expression de ce type de gène. Il est même recommandé de diminuer l’intensité du signal obtenu en cas de saturation du signal pour le contrôle si on veut quantifier ses bandes d’intérêts et normaliser par rapport au contrôle.

Si vous voulez tester plusieurs contrôles, il existe des « Loading control Antibody Sampler kits » incluant plusieurs en petit conditionnement de 20 µl (voir  tableau 1)

Choisir le bon contrôle de dépôt selon le poids moléculaire de sa protéine d’intérêt (Tableau 2)

Liste des « Loading control » conjugués ou non

Quelles sont les différentes stratégies de normalisation avec un contrôle de dépôt ?

Pour pouvoir « normaliser » l’intensité des bandes correspondantes à sa protéine d’intérêt, il faut pouvoir rapporter cette quantité à la quantité totale des protéines déposées ou à la quantité d’une protéine de ménage. Deux points sont à étudier :

  • A- Comment révéler 2 protéines en même temps sur une même membrane ?
  • B- Comment avoir pour les 2 protéines que l’on compare des données quantifiables, c'est-à-dire pour chacune un signal non saturant ?

A - Comment révéler deux protéines en même temps sur une même membrane ?

Plusieurs possibilités s’offrent à vous :

- Faire deux étapes d’hybridation l’une après l’autre à l’aide de deux anticorps avec une étape de déshybridation entre les deux :

  • Première étape avec l’anticorps primaire reconnaissant votre protéine d’intérêt
  • Déshybrider la membrane
  • Puis recommencer avec l’anticorps ciblant la protéine de ménage.
Cette technique consiste à révéler entièrement la protéine d’intérêt (jusqu’à la prise de vue), décrocher les anticorps primaires et secondaires avec un tampon contenant un détergent, et recommencer avec la protéine de ménage. Cela implique que l’étape de déshybridation doit être efficace et optimale car le risque est d’obtenir un bruit de fond du aux restes des anticorps de la première étape encore présents ou de décrocher une partie des protéines transférées sur la membrane, entrainant une perte de signal ou pas de signal lors de la seconde révélation.
 Vous comprendrez que cette stratégie n’est pas assez fiable pour normaliser et quantifier. Donc, elle est à éviter.

-Faire ses gels en double ou couper son gel en deux morceaux avant révélation (déposer en double vos échantillons)
On peut ainsi révéler chaque membrane avec des anticorps différents : une membrane révélée pour la protéine d’intérêt et la seconde pour la protéine de ménage. Mais vous ne pourrez jamais être complètement sur que le même échantillon déposé à partir d’un même tube sur deux pistes différentes contiennent exactement la même quantité de matériel (gel coupé en deux à la verticale). On ne peut pas écarter une différence induite par le pipetage (due à la viscosité, aux bulles après chauffage…), ni valider que migration et transfert sont identiques sur deux membranes différentes. Donc, ce n’est pas parfait non plus.

-Choisir des protéines de taille assez différente pour pouvoir révéler les deux protéines sur la même piste en découpant les languettes horizontales permettant de contenir chacune des protéines. Chaque languette est révélée indépendamment avec les anticorps adaptés à chaque protéine et on rassemble minutieusement chaque morceau pour la prise de vue.

Cette technique demande quelques ajustements :

  • Utiliser un marqueur pré-coloré multicolore précis permettant facilement de réaliser votre découpage après transfert
  • Bien orienter chaque languette par un repère (découpage de l’angle en haut à droite de chaque languette par exemple)
  • Tracer aux extrémités droites et gauches du blot des traits verticaux au crayon à papier permettant parfaitement de réaligner ses languettes lors de la prise de vue.

En bref, il faut être très méticuleux dans la préparation du découpage. Bien évidemment optimiser au préalable la révélation de vos WB avec une seule protéine et sans découpage pour être sûr de la zone dans laquelle le signal va apparaitre. Dans ce cas, il n’y a pas de biais du au dépôt.

-Après optimisation en simplex certains font du « mutiplexe-like » sans pouvoir distinguer la spécificité des signaux obtenus.
 En effet on peut incuber sa membrane en même temps avec 2 anticorps primaires, et ensuite avec un ou deux secondaires –HRP (selon l’origine des primaires (espèces différentes ou non). On révèle  ainsi ses deux bandes dans la même piste sans biais de pipetage. Cette technique n’est pas rigoureuse car on ne peut pas affirmer avec certitude que la bande observée corresponde à une protéine donnée puisqu’on a mélangé les primaires. C’est une alternative à l’approche du WB en fluorescence, qui permet d’identifier l’origine de chaque bande avec des primaires d’espèce différente et des secondaires conjugués à des fluorophores de couleur différente. A éviter si vous révélez en chimioluminescence.

B - Comment avoir pour les deux protéines que l’on compare des données quantifiables c'est-à-dire pour chacune un signal non saturant ?

Votre second problème vient des niveaux d’expression des deux protéines que vous voulez comparer. Je m’explique : votre protéine d’intérêt n’est pas fortement exprimée dans vos échantillons. Vous allez donc devoir ajuster le temps d’exposition pour arriver à distinguer une bande, plusieurs minutes par exemple. Pour la protéine de ménage on a en général une expression assez forte qui vous donne  un signal rapidement (en quelques secondes). Si vous calez votre temps d’exposition sur votre protéine d’intérêt vous obtiendrez pour la protéine de ménage une énorme bande mal résolue de type « patate ». Il y a fort à parier que le signal de cette bande sature et qu’il n’est plus quantifiable. Cela signifie aussi que cette quantification va sous-estimer la quantité réelle de la protéine. Votre normalisation sera complètement biaisée voir explications figure 1

gamme dynamique lineaire, signal non saturant

Même avec un imager de chimioluminescence récent (ayant une gamme dynamique étendue de l’ordre de 4 logs comparés à environ 1,5 log pour le film) vous serez fréquemment confronté à ce problème.

Nous pouvons avoir le même type de raisonnement en fonction de la quantité de protéines déposées. Pour votre protéine d’intérêt, il faut déposer par exemple 10 à 20 µg de protéines totales (à partir de culture de cellules lysées) pour un temps d’exposition donné (en minutes) pour avoir une bande détectable alors que 1 à 5 µg suffiraient pour détecter le protéine de ménage dans des conditions de révélation identiques (même temps d’exposition) voir figure 2

quantité de protéines déposées et saturation du signal

Pour ces deux cas, le but est d’abaisser le niveau de signal obtenu avec la protéine de ménage. Pour être dans des conditions linéaires, il faut soit modifier les temps d’exposition voir figure 3 , soit les quantités déposées voir figure 2 ci-dessus

Saturation du signal du au temps d’exposiition

 

Dans ce cas, plusieurs approches sont possibles :

  • Changer de protéine de ménage. Idéalement il faudrait avoir une protéine de ménage qui donne un signal plus faible et dont l’expression est invariable. Sachez qu’il existe des kits regroupant des anti-protéines de ménage, permettant d’en tester plusieurs et de sélectionner celle la plus adaptée.
  • Changer les conditions de révélation du signal de la protéine de ménage et être dans la partie linéaire de la courbe (signal non saturant)
    1. Changez les réactifs
    2. Changez les conditions
    3. Ajustez le temps d’exposition
    4. Changez les quantités déposées

L’idée est d’abaisser son niveau de signal pour être dans une partie linéaire de la courbe.
Au lieu de réaliser une révélation indirecte (anticorps primaire non marqué + secondaire HRP), testez le marquage direct (anticorps primaire directement conjugué à l’HRP) - Voir liste

En effet avec ce type de marquage, vous perdez l’amplification du signal qu’apporte un secondaire. Cell Signaling Technology propose un ensemble de contrôles de dépôt directement  conjugué à l’HRP. On peut aussi diluer un peu plus le primaire et le secondaire utilisés pour le contrôle de dépôt, mais l’effet sera négligeable.

Si cette baisse du niveau de signal obtenue par le marquage direct n’est pas suffisante, sachez qu’il est aussi possible d’ajuster en changeant de réactif de révélation ECL. Utilisez une ECL plus sensible vous permet de mieux détecter votre protéine d’intérêt avec un temps d’exposition plus court et donc qui induit un niveau de signal un peu moins fort pour la protéine de ménage.

La détection chimioluminescence (technique indirecte) utilisant l’ECL repose sur une réaction enzymatique, il faut donc s’assurer d’être dans la partie linéaire de la cinétique enzymatique (réaction proportionnelle au temps et à la quantité de substrat et d’enzyme (correspondant à l’antigène) dans la réaction). L’idéal est de tester la linéarité de la réaction ECL par une gamme de dilution sur un échantillon donné.

Pourquoi cette  détection en chimioluminescence utilisant l’ECL n’est pas toujours linéaire ? L’enzyme HRP (horseradish peroxidase) est utilisée comme rapporteur. Elle oxyde un substrat basé sur le luminol et produit transitoirement des photons. Les concentrations locales d’enzyme et de substrat sur la membrane peuvent impacter significativement la vitesse de la réaction enzymatique. C’est pour cette raison que l’on doit toujours travailler en excès de substrat. Mais il faut avoir en tête que la cinétique de la réaction sera modifiée en fonction de  l’abondance de la cible. C’est pour cette raison que la détection en fluorescence est considérée comme plus fiable pour la quantification car elle est directe (indépendante d’une réaction enzymatique).

Généralement on pense que pour comparer on doit avoir des temps d’exposition identiques pour les protéines que l’on compare. Oui et non. Visuellement nous sommes d’accord qu’il faut un même temps d’exposition pour pouvoir comparer. Mais ça n’est pas vrai pour quantifier de manière fiable.

En effet si vous coupez vos gels en languettes révélées par des anticorps différents (anti-protéine d’intérêt et anti-protéine de ménage) vous pouvez tout à fait utiliser des temps d’exposition différents pour quantifier. Voir figure 4A. Pour normaliser le signal de votre protéine d’intérêt par la quantité de protéine de ménage dans le même dépôt, vous pouvez comparer des valeurs d’intensité de signal (aire de votre pic) par unité de temps (seconde).

Cette valeur est intrinsèque à votre signal et l’intensité obtenue sera proportionnelle au temps d’exposition dans la partie linéaire (cela dépend de l’ECL utilisé et de la gamme dynamique de la caméra). Voir figure 4B
ajustement du temps d’exposition pour éviter la saturation du signal (1)
ajustement du temps d’exposition pour éviter la saturation du signal (2)
Modifier les quantités déposées de façon à être dans la partie linéaire pour votre protéine d’intérêt et pour votre protéine de ménage n’est pas réalisable car ça impliquerait de travailler en parallèle sur des dépôts différents ce qui biaiserait la normalisation (voir plus haut le cas du gel coupé en 2 à la verticale), il faut pouvoir normaliser par rapport au signal obtenus d’une même piste.

 

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