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Questions / Réponses de WB

Western Blot après IP
Comment éviter l’interférence avec les chaines d’IgG ayant servi à l’IP ?



Pourquoi observe-t-on une interférence ?

Quand on utilise un anticorps secondaire « classique » anti-IgG (H+L) pour détecter une protéine préalablement  immuno-précipitée par un anticorps primaire par WB, on détecte une bande à 25 kDa pour les chaines légères et une bande à 50 kDa pour les chaines lourdes correspondant à l’anticorps primaire utilisé pour l’IP. Ces bandes masquent couramment les bandes spécifiques de la protéine immuno-précipitée si elle a un poids moléculaire proche de 25 ou 50 kDa, et d’autant plus qu’ils sont en quantité importante. A tel point que la chaine lourde peut localement saturer la membrane et entrainer un transfert partiel des autres protéines dans la gamme de taille de 50-55 kDa. Cela a été montré par exemple pour la protéine P53 (réf .1).

Resituons le protocole pour bien comprendre. Lors de l’immuno-précipitation, on utilise un anticorps primaire produit dans une espèce donnée qui reconnait la protéine cible. Pour précipiter, on utilise la protéine A ou G conjuguée soit à des billes d’agarose/Sepharose® soit à des billes magnétiques. On peut utiliser aussi un primaire directement conjugué à des billes d’agarose/Sepharose® ou magnétiques ou bien un primaire biotinylé et de la streptavidine conjuguée à des billes d’agarose/Sepharose®.

Liste des réactifs secondaires pour l’IP

Liste des anticorps primaires biotinylés

Liste des anticorps primaires conjugués à des billes d’agarose ou billes magnétiques (anti-tag et autres)

Le précipitât contient la protéine cible, d’autres protéines interagissant avec la protéine cible, le primaire et le secondaire conjugué. On dénature le tout en présence de SDS et d’un agent réducteur (DTT et/ou béta-mercapto-éthanol) en faisant bouillir puis on dépose sur gel.

Le WB est révélé par un anticorps primaire (le même que dans l’étape d’IP ou non, selon le but de l’expérience (enrichissement, Co-IP) et les caractéristiques de l’anticorps), et classiquement par un anticorps secondaire reconnaissant l’espèce du primaire conjugué HRP.
Le souci est qu’un secondaire HRP « classique » reconnait aussi bien la forme native de l’anticorps primaire venant de la première étape de révélation du WB que le primaire dénaturé venant de l’IP. Il faut donc trouver une stratégie pour contourner ce problème.

Les différentes stratégies pour contourner ce problème d’interférence :

Utiliser deux anticorps primaires d’espèce sources différentes

Si vous utilisez pour l’IP et pour le WB, deux primaires issus d’espèce différente vous contournerez le problème et votre secondaire–HRP  ne reconnaitra que le primaire utilisé lors du WB.
Malheureusement, il est parfois difficile d’avoir accès à de bons anticorps spécifiques et sensibles venant de deux espèces différentes.

Utiliser un anticorps secondaire-HRP spécifique d’une seule chaîne

On peut  utiliser un anticorps anti-chaîne légère si sa protéine d’intérêt fait 50 kDa ou un anti-chaîne lourde ou anti-Fc si sa protéine fait 25 kDa. Les anticorps anti-Fc ou chaîne lourde (α, δ, ε, γ et μ) réagissent uniquement avec la chaîne lourde.



Anticorps secondaire anti-chaîne légère pour le WB après IP

Utiliser un anticorps secondaire-HRP spécifique de la conformation native de l’IgG

Et si on attend des bandes à 25 kDa et 50 kDa, on pourra utiliser un anticorps conformation-spécifique qui ne reconnait que les IgG natives et non dénaturées. Il ne reconnaitra donc que l’anticorps primaire du WB et pas l’anticorps primaire utilisé pour immuno-précipiter la protéine d’intérêt.

Anticorps secondaire conformation spécifique pour le WB après IP

Liste des secondaires adaptés au WB après IP (certains ne sont pas conjugués et nécessite l’utilisation d’un troisième anticorps)

 

Utiliser la protéine A ou la protéine-G conjuguée HRP à la place d’un anticorps secondaire-HRP

Il a été montré que la protéine A ou la protéine G conjuguée à l’HRP pouvaient être utilisées pour la détection de WB à la place du secondaire–HRP classique. En effet comme un anticorps, la protéine A ou G va reconnaitre la partie Fc du primaire mais  contrairement au secondaire classique qui fixe aussi bien les chaines lourdes et légères dénaturées sur la membrane, les protéines A ou G ne se fixent qu’aux IgG natives. De ce fait les protéines A ou G-HRP donnent qu’un signal spécifique de la protéine cible (réf. 2).
Voir les résultats de la publication

A noter cependant qu’on ne peut pas utiliser indifféremment la protéine A ou la protéine G, cela dépend de l’isotype de son primaire.
Voir les affinités relatives de la protéine A et de la protéine G en fonction des isotypes du primaire

Liste des produits

 

Eliminer les agents réducteurs dans le tampon de préparation de l’échantillon à déposer sur le gel

L’idée est de s’affranchir des bandes à 25 kDa et 50 kDa correspondant aux chaines légères et lourdes de l’anticorps en gardant l’anticorps primaire de l’IP sous sa forme tétramérique d’environ 160 kDa en poids apparent et en conservant les ponts disulfures. Pour ce faire, le tampon de solubilisation après l’IP est dépourvu d’agent réducteur et l’échantillon n’est pas bouilli.  Les ponts disulfures ne sont pas réduits. La limite de cette approche est de ne pas pouvoir étudier des protéines contenant des ponts disulfures.
Voir les résultats de la publication

Résultats d’IP après WB en éliminant les agents réducteurs

Utiliser un kit dédié comme ReliaBLOT™®

Il existe également des kits dédiés comme le kit ReliaBlot® de Bethyl Laboratories.
Ce type de kit permet de s’affranchir également des bandes des chaines d’IgG de 25 et 50 kDa.

Comparaison de résultats d’IP avec et sans ReliaBlot®

Le kit ReliaBlot® dont la nature des composants n’est pas publiée inclut un tampon de blocage spécifique, utilisé pour diluer le primaire du WB et d’un conjugué-HRP à diluer dans ce même tampon. Il n’est utilisable qu’avec un primaire de lapin.

Comment utiliser ReliaBlot® dans votre protocole ?

Ce kit est couramment cité dans des publications d’IP.
Voir la liste des publications ReliaBlot®

Comme nous l’avons vu plusieurs solutions simples s’offrent à vous. Choisissez en fonction de vos contraintes techniques.

Références Bibliographiques

Réf. 1
Wiese, C., and Galande, S. (2001). Elimination of reducing agent facilitates quantitative detection of p53 antigen. Biotechniques 30, 960-963. Article

Réf. 2
Lal A, Haynes SR, Gorospe M. Clean western blot signals from immunoprecipitated samples. Molecular and cellular probes. 2005;19(6):385-388. doi:10.1016/j.mcp.2005.06.007. Article

 

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