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Questions / Réponses de WB

Comment passer vos Western blots en Fluo !



Vous vous demandez si vous pouvez utiliser les anticorps Cell Signaling Technology pour des Western blots en fluorescence avec un secondaire conjugué à un fluorophore ?

Oui, c’est possible avec cependant quelques recommandations importantes à suivre.

Les couples d’anticorps à utiliser ensemble (anti-forme phosphorylée et anti-forme totale) n’ont pas été validés pour le WB en fluorescence par Cell Signaling Technology (sauf quelques exceptions, à lire sur la fiche technique fournie) ; il est donc possible que leur utilisation conjointe soit incompatible.

De plus, certaines paires d’anticorps primaires ne peuvent pas être utilisées ensemble pour plusieurs raisons comme par exemple :

  • Des épitopes superposés ou chevauchants
  • Des interférences (encombrement stérique) causées par les primaires et / ou les secondaires
  • Des tampons d’incubation des primaires incompatibles
En effet, dans ce type de protocole, les deux anticorps primaires utilisés devront être incubés simultanément avec la membrane.

Seul l’utilisateur pourra déterminer si les anticorps de son choix sont compatibles pour le WB en fluorescence lors de ses tests. On préconise donc de faire des tests de fluorescence avec chaque anticorps seul et de vérifier que le signal persiste si on passe au format multiplexe.

Cell Signaling Technology donne un protocole adapté et optimisé pour la détection en fluorescence pour ces anticorps avec une étape de blocage en TBS + 5 % de lait (sans Tween). Par ailleurs, le Tween peut être maintenu dans les tampons de dilution des anticorps ou le tampon de lavage.

Pour en savoir plus, voir les protocoles suivants :

Fluorescent Western Immunoblotting Protocol (Primary Ab Incubation In BSA)
Fluorescent Western Immunoblotting Protocol (Primary Ab Incubation In Milk)

Le WB en fluorescence est la technique idéale pour les WB quantitatifs.


- On peut détecter plusieurs protéines simultanément (multiplexage), ce qui permet de faire une normalisation par piste et détecter sa protéine d’intérêt et le contrôle de dépôt en même temps sur la même membrane.
  • - On peut également détecter et quantifier les modifications post-traductionnelles. Lors d’un WB en fluorescence, l’anticorps secondaire est directement conjugué à un fluorophore qui est excité par la lumière. La lumière émise est détectée par un imager ou un scanner et digitalisée pour l’analyse des données. Des protéines multiples sont détectées simultanément en utilisant des anticorps secondaires conjugués à des fluorophores différents ayant des spectres d’émission non chevauchants. Même si les différentes techniques de révélation en WB semblent similaires, il y a plusieurs facteurs à prendre en compte lorsque l’on passe d’un WB en chimioluminescence à un WB en fluorescence :

 

    • Titrer les anticorps secondaires et primaires. Utiliser la technique de dot blot pour estimer les concentrations optimales en anticorps primaires et secondaires.
    • Avant de multiplexer, il faut optimiser la détection de chaque cible individuellement.
    • La concentration des anticorps primaires doit être augmentée d’un facteur 2 à 5 par rapport à la chimioluminescence.
    • La concentration des secondaires nécessitent également d’être augmentée (1/5 000 est une dilution optimale de départ).
    • Utiliser une membrane PVDF avec un niveau d’auto-fluorescence faible. En effet, la nitrocellulose et certaines membranes PVDF génèrent une auto-fluorescence élevée et donc un fort bruit de fond.
    • Les encres et colorants (par ex. bleu de bromophénol et bleu de coomassie) peuvent aussi fluorescer. Ne marquer la membrane qu’avec un crayon à papier pour éviter ce problème.
    • Nettoyer correctement/minutieusement tout le matériel utilisé lors du WB pour éviter l’apparition de bruit de fond. Ne manipuler le gel et la membrane qu’avec des gants non talqués. Couvrir hermétiquement vos boites pendant l’incubation.
    • Si vous utilisez des marqueurs de taille fluorescents, laisser une piste vide entre le marqueur et les premiers échantillons déposés. Cela évite au marqueur de déborder dans les puits d’échantillons.
    • Attention la fluorescence se dénature à la lumière (phénomène de photoblanchiment ou photobleaching). Vous pouvez manipuler vos secondaires fluorescents normalement sur la paillasse mais il est important de bien les stocker à l’abri de la lumière (utiliser un tube en verre brun fourni par le fabriquant ou envelopper chaque tube avec du papier aluminium ou utiliser une boite de stockage opaque dans le réfrigérateur). Pour les mêmes raisons, conservez toujours vos blots à l’abri de la lumière pour éviter la disparition des signaux de fluorescence. 
    • Pour pouvoir multiplexer, il faut bien sûr diversifier vos sources de primaires en termes d’espèce. Les anticorps secondaires cross-adsorbés contre d’autres espèces permettent d’éviter des réactions croisées inter-espèces.
    • Eviter le chevauchement des spectres quand on multiplexe. Choisir des secondaires conjugués avec des fluorophores ayant des spectres non chevauchants.
    • Pour augmenter le signal spécifique, détecter toujours :
      • Le signal le plus fort (protéine-cible dont l’expression est la plus abondante) dans le canal bleu
      • Le signal d’intensité moyenne dans le canal vert
      • Et, le signal le plus faible dans le canal rouge

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