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Questions / Réponses de WB

Quel est l’impact de la taille de ma protéine sur mes résultats ?

Je travaille sur des protéines de petit poids moléculaire (< 30 kDa) et j’ai un doute sur le fait que cette protéine puisse passer à travers une membrane de 0,45 µm car je n’ai aucun signal. Que dois-je faire ?
Si vous ne souhaitez pas acheter une autre membrane pour vérifier cette hypothèse, faites un transfert avec 2 membranes de 0,45 µm positionnées l’une sur l’autre et révélez la seconde. Si votre protéine apparait sur la seconde membrane, ceci confirme qu’une membrane de 0,22 µm est nécessaire : car votre protéine est passée à travers la membrane de 0,45 µm.

 

Je travaille sur des protéines de haut poids moléculaire en Western blot, l’une fait environ 150 kDa et l’autre 500 kDa. Dois-je adapter mon protocole ?
Dans le cas d’une protéine de 150 kDa, il n’est pas nécessaire de modifier son protocole.
En revanche, Cell Signaling Technology utilise un protocole adapté pour les protéines de plus de 200 kDa.
Pour les protéines de plus de 200 kDa, on utilise des gels Tris-Acétate 3-8 % avec un tampon de migration Tris-Acétate-SDS à pH neutre. Cela permet d’avoir une meilleure résolution et une détermination de poids moléculaire plus précise vers 500 kDa comparé à un système Tris-Glycine. En complément, on recommande un transfert d’au moins 2 à 3 heures avec 10 % de méthanol dans le tampon de transfert au lieu des 20 % habituellement utilisés. Cela augmente l’efficacité de transfert des grosses protéines.

Pourquoi observe-t-on une différence entre la taille théorique attendue de sa protéine et celle réellement observée sur le gel ?
Le poids moléculaire théorique est le poids moléculaire calculé en multipliant le nombre d’acides aminés qui constituent la protéine par le poids moléculaire moyen d’un acide aminé ou plus précisément par la somme de tous les poids moléculaires des acides aminés constituant la protéine. Selon le mode de calcul vous pouvez avoir une différence significative de résultat pour les protéines n’ayant pas une composition très homogène en acides aminés. D’autre part, ce calcul ne tient pas compte des modifications post-traductionnelles (glycosylations notamment) qui peuvent exister chez les eucaryotes et impacter le poids moléculaire observé.
Une autre source de différence peut venir du protocole : l'absence de béta-mercapto-éthanol (ou de DTT) dans le bleu de migration permettant de préserver les ponts disulfures, font que les 2 sous-unités d’une protéine restent attachées et migrent sous la forme d’une seule entité de grande taille.
Cette différence peut tout simplement être due à une estimation imprécise due au marqueur de poids. En effet il faut avoir à l’esprit, qu’un marqueur pré-coloré est pratique mais reste imprécis. Il permet d’évaluer la taille de sa protéine d’un coup d’œil, mais ne permettra jamais d’évaluer précisément sa taille réelle. Une mesure précise doit être effectuée avec un marqueur non coloré. En effet les colorants qui sont greffés sur les protéines qui constituent le marqueur modifient leur taille et donc leur migration.

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