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Questions / Réponses de WB

Bien choisir ses contrôles en Western Blot

Dans un laboratoire, on reproduit très souvent et de manière empirique un protocole de Western blot habituellement utilisé. Puis un jour, malheureusement il ne fonctionne pas pour une nouvelle protéine d’intérêt à étudier …
Et, les retours de clients montrent que ce n’est pas forcement dû à l’anticorps. Si l’anticorps est de qualité et utilisé dans une application validée par le fabriquant, le problème vient très probablement d’ailleurs.
Et c’est là que les contrôles prennent tout leur sens. En effet, s’ils sont faits systématiquement, on pourra déduire d’une expérience qui ne fonctionne pas comme on l’attend, des hypothèses pour identifier la cause du problème … Et tester des adaptations du protocole pour remédier au problème.
Tous ces points sont présentés ci-dessous : pour connaitre les contrôles à utiliser, trop souvent oubliés, mais fortement recommandés.

Sommaire

Prévoir ses contrôles
Effectivement, il est essentiel de prévoir et d’inclure des contrôles adaptés.
Comme dans toute expérience, en WB des contrôles sont nécessaires pour vérifier qu’un résultat est un « vrai positif » ou qu’en l’absence de signal sur votre membrane que le résultat est réellement négatif.


De quels contrôles dispose-t-on ?

  • De contrôles de dépôt sur gel et ou transfert
  • De contrôles pour confirmer la présence de la protéine (pour les formes modifiées : phosphorylées par exemple)
  • De lysats cellulaires contrôles pour vérifier le fonctionnement de l’anticorps et de l’ensemble du protocole en amont et en aval 

Certains contrôles sont qualitatifs et d’autres quantitatifs.

Le bon contrôle de dépôt/transfert est un marqueur pré-coloré multi-couleurs pour vérifier rapidement pendant la migration et à l’issue du transfert que tout a correctement fonctionné.

Mais gardez à l’esprit, qu’un marqueur pré-coloré reste imprécis. Il permet d’évaluer la taille de sa bande en un coup d’œil, mais ne sera pas révélé lors de la prise de vue en chimioluminescence sauf si vous disposez d’un imager permettant de superposer une image visible (marqueur multicolore visible en noir et blanc) et des images de chimioluminescence.

Le marqueur pré-coloré multicolore LON00193837 ProSieve QuadColor Protein Marker est idéal pour un repérage facile et rapide.

Il existe des colorants de protéines sur blot pour vérifier la migration et le transfert ; de manière qualitative (Ponceau S Staining Solution #59803 ) ou quantitative en fluorescence (SYPRO Ruby Protein Blot Stain LON50565). Ils sont compatibles avec l’immuno-détection (voir paragraphe ci-dessous). Mais gardez en mémoire que si le transfert de votre protéine d’intérêt n’a pas fonctionné (notamment si c’est une protéine phosphorylée), ce type de contrôle donne seulement une idée globale de la qualité du transfert.

Pourquoi utiliser un contrôle de dépôt ?  
Les contrôles de dépôt sur gel sont utilisés pour confirmer que la quantité de protéines déposée est identique sur l’ensemble du gel. Ils permettent donc de normaliser le niveau de protéines détectées. Mais pour ce faire, le niveau d’expression de la protéine contrôle ne doit pas varier entre les différents types d’échantillons déposés sur un même gel. C’est essentiel pour la fiabilité et l’interprétation des résultats des Western blots. Il faut donc choisir une protéine dont on est absolument sûr que l’expression n’est pas modifiée en fonction des traitements ou des conditions (par exemple induction par une drogue) et selon le type d’échantillon. Il faut aussi adapter sa technique de préparation des échantillons. Si par exemple, vous prenez une protéine contrôle entièrement ou partiellement localisée dans le noyau, prévoyez un tampon de lyse assez efficace pour extraire et solubiliser l’intégralité des protéines nucléaires (par exemple : l’extraction/solubilisation de l’histone H3, la HDAC1 Histone deacetylase 1 et la cyclophiline B (PPIB) est incompatible avec une lyse au tampon NP-40 qui extrait uniquement les protéines cytosoliques et membranaires).

Choisir le contrôle de dépôt adapté à son échantillon :
Généralement, on choisit des protéines fortement exprimées de manière constitutive dans la lignée cellulaire ou dans l’échantillon étudié. Les protéines exprimées par des gènes de ménage (GAPDH, tubuline,…) sont souvent choisies pour cette raison.
Il faut également choisir une protéine de poids moléculaire différent de sa protéine d’intérêt pour être sûr de pouvoir distinguer les bandes (se reporter au tableau ci-dessous)
Il existe des anticorps primaires non couplés à utiliser en contrôle de dépôt, mais aussi des versions directement couplées à l’enzyme HRP permettant de gagner une étape. On perd une étape d’amplification par le secondaire, mais cette étape n’est souvent pas nécessaire vu le niveau élevé d’expression de ce type de gène. Il est même recommandé de diminuer l’intensité du signal obtenu en cas de saturation du signal obtenu par le contrôle si on veut quantifier ses bandes et normaliser par rapport au contrôle. 
Si vous voulez tester plusieurs contrôles, il existe des Loading control Antibody Sampler kits  qui en regroupent plusieurs en petit conditionnement de 20 µl.

Choisir le bon contrôle de dépôt en fonction du poids moléculaire de sa protéine d’intérêt

Liste des produits

Comment bien préparer des lysats cellulaires-contrôles positifs notamment pour les protéines phosphorylées ?
Si vous regardez une protéine non activée, l’idéal est de vous reporter à la fiche technique de l’anticorps qui montre des exemples de lignées cellulaires utilisées pour le contrôle positif ou négatif (comme QC en interne chez Cell Signaling Technology). Ce sont généralement des lignées classiques faciles à obtenir au laboratoire. Pour les protéines phosphorylées, la fiche technique montre la plupart du temps une lignée non induite (le contrôle négatif) et une lignée induite par un traitement (qui est précisé).

Accès au tableau CST en ligne listant les contrôles à utiliser

Certains de ces contrôles sont disponibles au catalogue (toujours en version set de 2 tubes un contrôle positif et un contrôle négatif)

 

Pourquoi doit-on révéler la protéine étudiée sous sa forme totale quand on s’intéresse à sa forme phosphorylée ?
C’est un contrôle qui permet de vérifier que la protéine est bien présente dans son échantillon. Il serait inutile de chercher à détecter sa forme phosphorylée si celle-ci n’est pas exprimée. La quantité de la forme phosphorylée à détecter est toujours beaucoup plus faible et peut être indétectable dans des conditions non induites. On est donc souvent obligé d’ajouter une condition induite en parallèle. Cela permet de valider que la phosphorylation a bien été conservée dans le lysat (ajout d’inhibiteurs de phosphatase, conservation de la phosphorylation lors de la migration/transfert). En effet, la phosphorylation est assez instable et labile et peut être perdue lors de la manipulation. Parfois cette induction est si faible qu’il est nécessaire de faire une première étape d’immuno-précipitation de la protéine d’intérêt par l’anticorps anti-forme totale (« concentre » l’échantillon), puis de réaliser un WB à partir de ce que l’on a immuno-précipité pour détecter la forme activée à l’aide d’un anticorps anti-forme phosphorylée.

 

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