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TechOzyme - avril 2017

Tout ce que vous n’avez jamais osé demander
pour optimiser votre protocole habituel de Western blot

Dans un laboratoire, on reproduit très souvent et de manière empirique un protocole de Western blot habituellement utilisé. Puis un jour, malheureusement il ne fonctionne pas pour sa protéine d’intérêt …
Et, ce n’est pas forcement dû à l’anticorps. Si l’anticorps est de bonne qualité et utilisé dans une application validée par le fabriquant, le problème vient très probablement d’ailleurs.

Différentes questions se posent et des points sont à vérifier pour modifier votre protocole habituel. Par exemple, selon la protéine étudiée (taille et localisation cellulaire), selon les anticorps utilisés (source, pureté, concentration), selon la nature des échantillons (cellules en culture ou tissus) et s’ils ont été induits ou non par des traitements/drogues.

Il faut également s’assurer que la protéine cible est suffisamment exprimée pour être détectée en WB. Certes contraignant, mais cela évite les pertes de temps.

Tous ces points sont présentés dans ce TechOzyme ainsi qu’un grand nombre d’optimisations pour adapter son protocole habituel de Western blot et les contrôles à utiliser, trop souvent oubliés, mais fortement recommandés.

Sommaire

Vos échantillons : préparation et conservation

Préparation des lysats : quel tampon utiliser ?
Choisir le tampon en fonction de la nature de l’échantillon (cellules ou tissus) et de la protéine cible. 

Si le tampon n'est pas adapté, la lyse peut être incomplète, et le niveau de protéine détecté ne sera pas reproductible d'un échantillon à l'autre. En effet, tous les tampons de lyse n'ont pas la même capacité à solubiliser les protéines.

En fait tout dépend des échantillons. Le SDS Sample Buffer est adapté pour les cellules en culture. Ce tampon existe avec un colorant rouge ou bleu (Blue Loading Buffer Pack #7722S ou Red Loading Buffer Pack #7723S). Mais attention, il n'est pas toujours compatible avec un dosage de protéines totales car il contient un agent réducteur (DTT ou béta-mercaptoéthanol). Tous les kits de dosage de protéines de type BCA, Bradford, Lowry ne sont pas compatibles avec  les agents réducteurs ; vérifier sur les fiches techniques des kits de dosage.

Liste des réactifs de dosage de protéines

Pour les tissus, le RIPA buffer #9806S ou le Cell Lysis buffer #9803S   sont plus efficaces (incluent un détergent plus fort).
Dans le cas du Cell Lysis buffer #9803S  sur tissus, il est recommandé de l’utiliser en formulation 2X. En effet, doubler la quantité d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases donne de meilleurs résultats sur les tissus.
Le Cell Lysis buffer (#9803S)   peut aussi être utilisé pour les immuno-précipitations ou les tests d’activité kinase.

Lors de la préparation des lysats, il ne faut pas oublier d’ajouter les inhibiteurs de phosphatases (pour l'étude des protéines phosphorylées) et de protéases pour éviter la dégradation (voir ci-dessous).

inhibiteurs de protéases et de phosphatases pour préparer vos lysats

Le Chaps Cell Extract Buffer (#9852S) est approprié pour préparer des fractions cytoplasmiques et est très utilisé pour les études sur la signalisation des caspases.

Le kit Cell Fractionation (#9038S) est dédié à la préparation des fractions cellulaires cytoplasmiques, membranes/organelles, et noyau/cytosquelette.

Attention, des tampons doux comme le NP-40 lysis buffer, à base de détergent non-ionique souvent utilisé empiriquement, ne permettent d’obtenir que la fraction cytosolique ou les protéines liées à la membrane. La fraction nucléaire est précipitée avec les débris cellulaires et éliminée. A éviter, si vous étudiez une protéine nucléaire ou partiellement localisée dans le noyau. Dans ce cas, le RIPA buffer est beaucoup plus efficace et permet de lyser le noyau et de solubiliser les protéines nucléaires.

Compositions des tampons de lyse et des inhibiteurs

Comment choisir son tampon de lyse et les additifs à rajouter ?

Liste des produits (tampons de lyse et inhibiteurs)


Sonication des échantillons

  • - Pourquoi dois-je soniquer mes échantillons ?

La sonication est la technique d'extraction de protéines la plus efficace. Elle rend les échantillons moins visqueux en cassant l’ADN et les membranes. Cell Signaling Technology recommande 3 pulses de 10 secondes à 35-40 % de puissance (ou environ 15 W) avec un sonicateur à sonde (à ajuster selon le type de sonicateur) et avec une pause de 10 secondes dans la glace entre chaque pulse. La sonication est particulièrement importante pour les facteurs de transcription et les protéines nucléaires associées à la chromatine (voir exemple ci-dessous), puisqu'elle va fractionner l'ADN et les membranes. Soniquer les échantillons donne une préparation de lysats plus reproductible et facilite la comparaison des résultats entre échantillons.

Si vous n'avez pas de sonicateur au laboratoire, vous pouvez faire passer vos échantillons à travers l'aiguille fine d'une seringue.

Même si vous ne travaillez pas sur des protéines nucléaires, cette étape de sonication n'est pas superflue ; le fait de diminuer la viscosité de l’échantillon facilite le pipetage de l'échantillon lors du dépôt sur gel, réduit les erreurs et normalise les dépôts.

Voir la comparaison de WB sur les mêmes échantillons soniqués ou non (extraits cellulaires CKR/PAEC) avec l'anticorps Phospho-Histone H3 (Ser10) Antibody #9701
Comparaison de WB sur les mêmes échantillons soniqués ou non (extraits cellulaires CKR/PAEC) avec l'anticorps Phospho-Histone H3 (Ser10) Antibody #9701
  • - Quel sonicateur utiliser ?

Les sonicateurs de type bain à ultrasons ne sont pas assez efficaces pour casser l’ADN et les membranes. Les sonicateurs à sonde microplongeante sont davantage adaptés, et utilisés par Cell Signaling Technology (sonic dismembrators de Thermo Fisher).

 

 

Conservation des échantillons de protéines phosphorylées en SDS 
Les lysats en SDS peuvent être conservés à -20°C pour du court terme (moins de 3 mois) et -80°C pour du long terme. La dégradation des protéines activées varie beaucoup selon les échantillons. Cela dépend de la nature de chaque protéine et aussi de la quantité de protéines activées dans l’échantillon.

En général, les extraits cellulaires de cellules primaires et de tissus génèrent moins de bruit de fond et de produits de dégradation que des extraits issus de lignées cellulaires. D’autre part, une lyse en tampon riche en détergent comme le RIPA buffer donne une lyse beaucoup plus complète comparée à une lyse en tampon standard. Un lysat un peu ancien peut donner un signal spécifique plus faible et un plus haut niveau de bruit de fond à cause des produits de dégradation visibles sous forme de « smear ».

utiliser un lysat frais donne un meilleur signal

Les contrôles : les prévoir à l’avance

Comme dans toute expérience, en WB des contrôles sont nécessaires pour vérifier qu’un résultat est réellement négatif si vous n’obtenez pas de signal sur votre membrane,  ou positif quand un signal apparait.

De quoi dispose-t-on ?

  • Des contrôles de dépôt sur gel et ou transfert
  • Des contrôles pour confirmer la présence de la protéine (pour les formes modifiées : phosphorylées par exemple)
  • Des lysats cellulaires contrôles pour vérifier le fonctionnement de l’anticorps et de l’ensemble du protocole en amont et en aval 

A noter aussi que certains contrôles sont qualitatifs et d’autres quantitatifs.

Le bon contrôle de dépôt/transfert est un marqueur pré-coloré multi-couleurs pour vérifier rapidement pendant la migration et à l’issue du transfert que tout a bien fonctionné.

Mais avoir à l’esprit, qu’un marqueur pré-coloré même pratique reste imprécis. Il permet d’évaluer la taille de sa bande d’un coup d’œil, mais ne sera pas révélé lors de la prise de vue en chimioluminescence sauf si vous disposez d’un imager permettant de superposer une image visible (marqueur multicolore visible en noir et blanc) et des images de chimioluminescence. Le marqueur pré-coloré multicolore  LON00193837 ProSieve QuadColor Protein Marker est idéal pour un repérage facile et rapide.

Il existe des colorants de protéines sur blot pour vérifier de manière qualitative (Ponceau S Staining Solution #59803) ou quantitative en fluorescence (SYPRO Ruby Protein Blot Stain LON50565) la migration et le transfert. Ils sont compatibles avec l’immuno-détection (voir paragraphe ci-dessous).



Comment bien préparer des lysats cellulaires-contrôles positifs notamment pour les protéines phosphorylées ?

Si vous regardez une protéine non activée, l’idéal est de vous reporter à la fiche technique de l’anticorps qui montre des exemples de lignées cellulaires utilisées pour le contrôle positif ou négatif (comme QC en interne chez Cell Signaling Technology). Ce sont généralement des lignées classiques faciles à obtenir au laboratoire. Pour les protéines phosphorylées, la fiche technique montre la plupart du temps une lignée non induite (le contrôle négatif) et une lignée induite par un traitement (qui est précisé).

Accès au tableau CST en ligne listant les contrôles à utiliser

Certains de ces contrôles sont disponibles au catalogue (toujours en version set de 2 tubes un contrôle positif et un contrôle négatif)


Pourquoi utiliser un contrôle de dépôt ?

Les contrôles de dépôt sur gel sont utilisés pour confirmer que la quantité de protéines déposée est identique sur l’ensemble du gel. Ils permettent donc de normaliser le niveau de protéines détectées. Mais pour ce faire,  le niveau d’expression de la protéine contrôle ne doit pas varier entre les différents types d’échantillons déposés sur un même gel. C’est essentiel pour la fiabilité et l’interprétation des résultats de vos Western blots. Il faut donc choisir une protéine dont on est absolument sûr que l’expression n’est pas modifiée en fonction des traitements ou des conditions (par exemple induction par une drogue) et des types d’échantillons. Il faut aussi adapter sa technique de préparation des échantillons. Si par exemple, vous prenez une protéine contrôle entièrement ou partiellement localisée dans le noyau, prévoyez un tampon de lyse assez efficace pour extraire et solubiliser l’intégralité des protéines nucléaires (par exemple : l’extraction/solubilisation de l’histone H3, la HDAC1 Histone deacetylase 1 et la cyclophiline B (PPIB) est incompatible avec une lyse au tampon NP-40 qui extrait uniquement les protéines cytosoliques et membranaires).

 

Choisir le contrôle de dépôt adapté à son échantillon :

Généralement, on choisit des protéines fortement exprimées de manière constitutive dans la lignée cellulaire ou dans l’échantillon étudié. Les protéines exprimées par des gènes de ménage  (GAPDH, tubuline,…) sont souvent choisies pour cette raison.

Il faut également choisir une protéine de poids moléculaire différent de sa protéine d’intérêt pour être sûr de pouvoir distinguer les bandes (se reporter au tableau ci-dessous)
Il existe des anticorps primaires non couplés à utiliser en contrôle de dépôt, mais aussi des versions directement couplées à l’enzyme HRP permettant de gagner une étape. On perd une étape d’amplification par le secondaire, mais cette étape n’est souvent pas nécessaire vu le niveau élevé d’expression de ce type de gène. Il est même recommandé de diminuer l’intensité du signal obtenu en cas de saturation du signal obtenu par le contrôle si on veut quantifier ses bandes et normaliser par rapport au contrôle.  Si vous voulez tester plusieurs contrôles, il existe des Loading control Antibody Sampler kits  qui en regroupent plusieurs en petit conditionnement de 20 µl.

Choisir le bon contrôle de dépôt en fonction du poids moléculaire de sa protéine d’intérêt

Liste des produits

 

Pourquoi doit-on révéler la protéine étudiée sous sa forme totale quand on s’intéresse à sa forme phosphorylée ?

C’est un contrôle qui permet de vérifier que la protéine est bien présente dans son échantillon. Il serait inutile de chercher à détecter sa forme phosphorylée si celle-ci n’est pas exprimée. La quantité de la forme phosphorylée à détecter est toujours beaucoup plus faible et peut être indétectable dans des conditions non induites. On est donc souvent obligé d’ajouter une condition induite en parallèle. Cela permet de valider que la phosphorylation a bien été conservée dans le lysat (ajout d’inhibiteurs de phosphatase, conservation de la phosphorylation lors de la migration/transfert). En effet, la phosphorylation est assez instable et labile et peut être perdue lors de la manipulation. Parfois cette induction est si faible qu’il est nécessaire de faire une première étape d’immuno-précipitation de la protéine d’intérêt par l’anticorps anti-forme totale (« concentre » l’échantillon), puis de réaliser un WB à partir de ce que l’on a immuno-précipité pour détecter la forme activée à l’aide d’un anticorps anti-forme phosphorylée.

Le gel : migration et transfert

Quelle quantité de protéines charger sur son gel ?

On dépose habituellement 20-30 µg / puits de protéines totales pour des extraits cellulaires et 80 à 100 µg pour des extraits de tissus.

 

Quelle méthode de transfert est recommandée ?

Cell Signaling Technology a montré que les transferts secs ou semi-secs ne sont pas les plus efficaces. Si possible, il est recommandé d’utiliser un transfert liquide dans un appareil où les blots sont complètement immergés dans le tampon de transfert. Le protocole recommandé est un transfert à une intensité de 250 mA ou un voltage de 70 V pendant 2 h dans le tampon classique Tris-Glycine suivant : 25 mM Tris base (pH ajusté à 8.5), 0.2 M glycine, 20% méthanol.

Attention, on cherche souvent à remplacer le méthanol qui est toxique par de l’éthanol ; mais l’éthanol n’a pas une efficacité identique au méthanol pour le transfert.

A noter que le pourcentage de méthanol peut être abaissé à 10 % dans le cas de protéines de haut poids moléculaire.

Le transfert classique en liquide est plus efficace

La révélation : choix des réactifs 

Choix du tampon de dilution et de lavage :

  • 1 - Puis-je utiliser du PBS-T à la place du TBS-T? 

Ce n’est pas recommandé. La performance des anticorps et leur fixation peut être affectée par la substitution du tampon. Le TBS-T donne un signal plus fort que le PBS-T comme tampon de dilution et tampon de lavage. Voir l’exemple ci-dessous :

le tampon TBST donne un meilleur signal que le tampon PBST
  • 2 - Puis-je diluer tous mes anticorps primaires en lait ?

Non, le tampon de dilution optimal figure sur la fiche technique. En général, les anticorps de lapin sont incubés en TBS-T + 5 % BSA et ceux de souris en TBS-T + 5 % lait. Mais, il y a toujours des exceptions. Parfois, il est recommandé d’incuber certains anticorps de souris en BSA car le lait « quenche » le signal. Voir l’exemple ci-dessous avec le Phospho-Akt (Ser473) Antibody #9271 :

un tampon de dilution du primaire avec de la BSA donne un signal plus fort

Puis-je incuber mon anticorps primaire pendant 2 h à RT au lieu de la nuit à +4°C ?

Les anticorps de Cell Signaling Technology spécifiques des formes activées sont purifiés pour pouvoir distinguer seulement un ou deux résidus modifiés après la traduction. Ces modifications incluent la phosphorylation, l’acétylation et le clivage enzymatique.

La majorité des anticorps dirigés contre ces sites modifiés a une affinité plus faible quand on compare avec des anticorps reconnaissant la protéine complète. De ce fait, il est essentiel de prolonger le temps d’interaction anticorps-antigène pour avoir un meilleur ratio signal / bruit de fond en incubant à +4°C toute la nuit (voir ci-dessous).

le signal est plus fort en incubant le primaire à +4°C toute la nuit

Que recommande-t-on pour détecter le signal de l’ECL ? Film ou caméra CCD ?

Cell Signaling Technology utilise un système de caméra. Une comparaison entre film et caméra a été réalisée avec une grande variété de réactifs ECL. Les temps d’exposition obtenus peuvent être différents, mais les deux sont utilisables. Si les temps nécessaires pour obtenir un signal sont très longs, il faut changer le réactifs ECL et passer à un système plus sensible. Cela implique également des ajustements de la concentration de l’anticorps secondaire.

 

Que faut-il savoir sur la compatibilité d’un anticorps secondaire et d’un réactif de détection ECL ?


En Western blot, on utilise un réactif de détection de type ECL avec un secondaire conjugué à l’enzyme HRP. Il existe de nombreux types de réactifs ECL disponibles ayant des sensibilités très variables et permettant de détecter des protéines de quelques dizaines de femtogrammes à quelques dizaines de picogrammes (seuil de détection).
De ce fait, il faut adapter la concentration finale de son secondaire-HRP en fonction du réactif ECL choisi. En effet,  plus le réactif de révélation est sensible, plus il faudra diluer son secondaire d’une dilution 5 000 à 500 000 environ (dans le cas où son secondaire est concentré à 1 mg/ml).

Lorsque que vous changez votre réactif ECL pour augmenter la sensibilité, n’oubliez pas d’ajuster la concentration de votre secondaire, sinon vous risquez de générer du bruit de fond et inversement vous risquez de perdre votre signal.

Pensez également,  lorsque vous changez d’anticorps secondaire à ajuster sa dilution ; « en concentration » et non automatiquement « en dilution » car tous les secondaires commerciaux ne sont pas formulés à 1 mg/ml.

Liste des produits
adaptation de la dilution du secondaire en fonction de l’ECL utilisé

Questions fréquemment posées

Puis-je utiliser les anticorps Cell Signaling Technology pour un Western blot en fluorescence avec un secondaire conjugué à un fluorophore ?

Oui, c’est possible. Cependant, les couples d’anticorps à utiliser ensemble (anti-forme phosphorylée et anti-forme totale) n’ont pas été validés pour le WB en fluorescence par Cell Signaling Technology (sauf exception, voir fiche technique fournie) ; il est possible que leur utilisation conjointe soit incompatible.

De plus, certaines paires d’anticorps primaires ne peuvent pas être utilisées ensemble pour plusieurs raisons comme par exemple :

  • Des épitopes superposés ou chevauchants
  • Des interférences (encombrement stérique) causées par les primaires et / ou les secondaires
  • Des tampons d’incubation des primaires incompatibles

En effet, dans ce type de protocole, les deux anticorps primaires utilisés devront être incubés simultanément avec la membrane.

Seul l’utilisateur pourra déterminer si les anticorps de son choix sont compatibles pour le WB en fluorescence lors de ses tests. On préconise donc de faire des tests de fluorescence avec chaque anticorps seul et de vérifier que le signal persiste si on passe au format multiplexe.

Cell Signaling Technology donne un protocole adapté et optimisé pour la détection en fluorescence avec un blocage en TBS + 5 % lait (sans Tween). Par ailleurs, le Tween peut être maintenu dans les tampons de dilution des anticorps ou le tampon de lavage. Pour en savoir plus, voir les protocoles suivants :

Fluorescent Western Immunoblotting Protocol (Primary Ab Incubation In BSA)

Fluorescent Western Immunoblotting Protocol (Primary Ab Incubation In Milk)

 

D’autre part, les standards précolorés en bleu comme le Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa) (#13953S) sont auto-fluorescents à des longueurs d’onde proche de l’infra-rouge.

Pour une révélation de WB en fluorescence, on utilise généralement des secondaires permettant de faire une révélation en multiplexe classiquement avec une longueur d’onde d’excitation proche de l’infra-rouge (680, 770, 790 et 800 nm). La lecture se fait sur LI-COR Odyssey® imaging systems ou sur un imager avec caméra équipée de LED comme source d’excitation. On utilise dans ce cas des DyLight™, des Alexa Fluor®, ou des CF™ Dyes.

Liste des anticorps secondaires adaptés pour le WB révélé en fluorescence

 

Quels sont les anticorps secondaires à choisir pour une détection de WB en chimioluminescence ?

On utilise en général des anticorps secondaires IgG (H+L) couplés HRP pour la révélation des WB en chimioluminescence avec un réactif de détection de type ECL.

Liste des anticorps secondaires adaptés au WB révélé en chimioluminescence

 

Pourquoi ne pas utiliser le protocole habituel de WB de son laboratoire ?

Il n’existe pas de protocole universel de WB.

Il est essentiel de suivre le protocole optimisé proposé par Cell Signaling Technology pour leurs anticorps car il garantit l’obtention d’un meilleur signal avec un bruit de fond minimal. Vous gagnerez du temps et des réactifs en l’utilisant.

 

Comment s’assurer de la reproductibilité de ses résultats de WB ?

Si vous avez des difficultés à répéter vos résultats, il y a des causes connues.

Voici les questions à se poser ou les conseils à prendre en compte :

  • La conservation de l’anticorps respecte-t-elle les recommandations de Cell Signaling Technology ?
  • Les dilutions d’anticorps primaires ne doivent pas être ré-utilisées. Beaucoup d’anticorps s’utilisent à une concentration finale faible et il est possible que la concentration diminue à chaque nouveau WB car l’anticorps est épuisé.
  • Etes-vous certain que la forme activée que vous souhaitez détecter est bien présente dans vos échantillons et en quantité suffisante pour être révélée ? D’une expérience à l’autre, le nombre de cellules, le temps d’induction par une drogue, le nombre de passages et les conditions de stockage du lysat peuvent significativement faire varier la quantité de cette forme activée.
  • Le signal obtenu est optimal pendant la garantie de l’anticorps (24 mois pour un anticorps non conjugué après la date d’essai inscrite sur l’étiquette du tube chez Cell Signaling Technology). Evitez d’utiliser un anticorps après sa date d’expiration.
  • Evitez d’aliquoter les anticorps. En effet, ils sont conditionnées dans un tampon contenant 50 % de glycérol et supportent donc les sorties répétées du congélateur car ils ne congèlent pas. En raison de la viscosité du tampon, vous risquez de « perdre » votre anticorps lors d’un aliquotage.
  • Si vous obtenez un signal intense à la mauvaise taille, intéressez-vous aux isoformes potentielles de votre protéine d’intérêt. Vérifiez sur la fiche technique de l’anticorps primaire quelles sont les isoformes de la protéine reconnues par l’anticorps. Certaines isoformes ne sont présentes que dans certains tissus ou cellules.

Astuces

Je travaille sur des protéines de petit poids moléculaire (< 30 kDa) et j’ai un doute sur le fait que cette protéine puisse passer à travers une membrane de 0,45 µm car je n’ai aucun signal. Que dois-je faire ?

Si vous ne souhaitez pas acheter une autre membrane pour tester cette hypothèse, faites un transfert avec 2 membranes de 0,45 µm l’une derrière l’autre et révélez la seconde. Si votre protéine apparait sur la seconde membrane, c’est qu’une membrane de 0,22 µm est nécessaire : car votre protéine est passée à travers la membrane de 0,45 µm.

 

 

Je travaille sur des protéines de haut poids moléculaire en Western blot, l’une fait environ 150 kDa et l’autre 500 kDa. Dois-je suivre un protocole spécial ?

Cell Signaling Technology utilise un protocole adapté pour les protéines de plus de 200 kDa. Dans le cas d’une protéine de 150 kDa, ce n’est pas nécessaire.

Pour les protéines de plus de 200 kDa, on utilise des gels Tris-Acétate 3-8 % avec un tampon de migration Tris-Acétate-SDS à pH neutre. Cela permet d’avoir une meilleure résolution et une détermination de poids moléculaire plus précise vers 500 kDa comparé à un système Tris-Glycine. En complément, on recommande un transfert d’au moins 2 à 3 heures avec 10 % de méthanol dans le tampon de transfert au lieu des 20 % habituellement utilisés. Cela augmente l’efficacité de transfert des grosses protéines.

 

Je travaille sur une espèce–modèle moins courante sur laquelle les anticorps de Cell Signaling Technology ne sont pas testés en routine lors des étapes de validation (hors humain, rat, souris testés en standard).

Comment savoir si un anticorps Cell Signaling Technology va reconnaitre ma protéine chez mon espèce (drosophile, C. elegans, xénope, boeuf, porc,…) ?

Beaucoup de voies de transduction sont très conservées chez les eucaryotes supérieurs. Demandez-nous avant de tester cet anticorps si la protéine–cible présente une homologie significative (> 85 %) au niveau de la séquence du peptide antigénique utilisé pour produire cet anticorps. Si c’est le cas, c’est un indice montrant la réactivité probable de cet anticorps avec votre protéine-cible. Vous gagnerez du temps en ne testant pas les anticorps qui n’ont pas au moins ce pourcentage d’homologie.

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