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TechOzyme - décembre 2017

Réussir ses clonages avec la technologie In-Fusion®

Réussir ses clonages avec In-Fusion®

Le clonage de produits de PCR est une technique utilisée en routine dans les laboratoires. Initialement réalisé par digestion en présence d’enzyme(s) de restriction de l’insert et du vecteur puis action d’une ligase, par clonage TA ou par recombinaison, les techniques ont évolué afin de répondre aux besoinx des utilisateurs :

  • Cloner dans un site défini du plasmide dépourvu de site de restriction
  • Cloner de façon directionnelle dans le vecteur de son choix
  • Cloner de façon « seamless » sans ajout de base
  • Cloner simultanément plusieurs fragments (par exemple promoteur + gène + tag)
  • Cloner des grands fragments

Exempte des limitations classiquement rencontrées dans les méthodes de clonage traditionnelles, la technologie In-Fusion®, citée dans plus de 1800 publications, est unique dans sa capacité à simplifier les étapes de clonage. Elle assure un taux d’efficacité élevé, même pour les clonages difficiles.

A travers ce TechOzyme, nous aborderons les applications possibles avec le kit In-Fusion®, ainsi que les bonnes pratiques pour la réussite des clonages. Les outils pour le design des amorces et les questions fréquemment posées seront également présentés.

Sommaire

Principe de la technologie In-Fusion®

Cette technologie repose sur la fusion de 15 pb communes à l’insert et au vecteur utilisés pour le clonage.

Préparation de l’insert (promoteur, gène d’intérêt, tag, etc…) :

Tout d’abord, l’insert est amplifié par PCR. 15 bases, homologues aux extrémités du vecteur, sont ajoutées en 5’ de chaque amorce. Il est également possible d’utiliser des oligos qui seront hybridés 2 à 2, ou des ADN double brins linéaires (type GBlocks).

Préparation du vecteur :

Pour préparer un vecteur compatible avec l’insert, celui-ci doit être linéarisé. Cette étape peut se faire par digestion enzymatique ou en amplifiant le vecteur par PCR inverse.

Mélange de l’insert et du vecteur :

L’insert et le vecteur sont incubés en présence du mix In-Fusion®. L'enzyme In-Fusion® crée des régions ADN simple brin aux extrémités du vecteur linéaire et de l’insert, ces séquences complémentaires ainsi créées vont spontanément s’hybrider pour former le vecteur recombinant souhaité.

Transformation des cellules compétentes avec le mix In-Fusion®

La dernière étape consiste à transformer des cellules compétentes, l’ADN sera alors ligué par l’enzyme bactérienne. Le clone est ainsi obtenu en 1 étape.

Ainsi, la technologie In Fusion est compatible avec tout insert, tout vecteur, sans aucune restriction et permet un clonage directionnel et sans ajout de bases.

Principe de la technologie In-Fusion®

La technologie In-Fusion® permet également le clonage de plusieurs fragments de PCR simultanément. Dans ce cas, chaque fragment aura une zone homologue avec le fragment précédent (qui peut être le vecteur ou un autre fragment PCR) ainsi que le suivant.

clonage de 2 fragments avec In-Fusion®

Quel système choisir ?

Les kits In-Fusion® existent sous plusieurs formats  :
  • Formats liquides « In-Fusion® HD Cloning Plus » incluant une enzyme PCR haute fidélité CloneAmp™ HiFi, les cellules compétentes Stellar™ et le « Cloning Enhancer » ou les colonnes NucleoSpin pour purifier l’insert
  • Formats lyophilisés « EcoDry™ » se stockant à température ambiante
  • Formats incluant des colonnes de purification « Nucleospin » pour la purification de l’insert sur colonne après migration et découpage de la bande d’intérêt
  • Formats incluant le « Cloning Enhancer » permettant de traiter le produit de PCR en s’affranchissant de la purification sur gel/colonne, utilisables uniquement lorsque l’amplification PCR génère un seul fragment à la taille attendue (c’est-à-dire que son analyse sur gel montre une bande spécifique sans aucune bande contaminante).

En première intention, nous recommandons les kits complets version Plus en format liquide incluant les cellules compétentes et les colonnes de purification qui sont adaptés à tous les clonages.

Composition des kits In-Fusion® version Plus (avec enzyme PCR)

Composition des kits In-Fusion®

Les étapes clés du clonage In-Fusion®

Design des amorces PCR
Lors de l’amplification du produit PCR, 15 bases, homologues aux extrémités du vecteur sont ajoutées en 5’ de chaque amorce. Le nombre de bases ajouté est de 20 pour le clonage multi-fragments. La conception est réalisée facilement grâce à un outil en ligne très intuitif « Primer Design Tool »
Tuto : comment designer les amorces In-Fusion® ?

Préparation des fragments PCR à cloner
- Amplification PCR
Tous les types d’enzyme PCR, générant des bouts francs ou des extrémités A-sortantes, sont compatibles avec la technologie In-Fusion®.

Nous recommandons d’utiliser une enzyme très haute fidélité comme l’enzyme CloneAmp HiFi incluse dans les formats de kits In-Fusion® Plus.


In-Fusion® : Enzyme haute fidélité CloneAmp HiFi
- Purification des inserts amplifiés par PCR

Si l’insert amplifié donne une bande spécifique et unique, la purification se fait par l’ajout du Cloning Enhancer directement dans le mix de PCR ou sur colonne.
Si l’insert amplifié contient des bandes non spécifiques, la purification se fait en découpant la bande spécifique après migration sur gel, puis passage sur colonne.

 

  • Préparation du vecteur de clonage
    • - Linéarisation du vecteur

Digérez le vecteur de façon efficace (100%) avec une enzyme de restriction, idéalement avec deux enzymes.
En clonage multi-fragments, digérez le vecteur seulement 2-3 h avec des enzymes de restriction et non toute la nuit pour conserver les extrémités intactes.
L’obtention du vecteur sous la forme d’un fragment double brin linéaire peut être également réalisée par amplification PCR à partir du vecteur circulaire. Dans ce cas, une PCR inverse, c’est-à-dire à l’aide d’amorces orientées en sens inverse, est réalisée.

    • - Purification du vecteur linéarisé

Le vecteur est purifié en découpant la bande après migration sur gel puis passage sur colonne.

  • Préparation du mix In-Fusion®

De façon générale, on prépare le mix In-Fusion® avec 10-200 ng d’insert et 50-200 ng de vecteur linéarisé, le ratio molaire insert/vecteur recommandé est de 2/1.

Plusieurs facteurs sont à prendre en compte pour optimiser les conditions – voir page 10 du manuel d’utilisation

  • Transformation des cellules compétentes avec le mix In-Fusion®

Toutes les bactéries ne sont pas compatibles avec la technologie In-Fusion® (voir Questions fréquemment posées).
Les cellules Stellar™, incluses dans certains formats de kits In-Fusion®, sont celles donnant la meilleure efficacité de clonage, tout en permettant de travailler avec des tailles de fragments/vecteur élevées.
La compétence des cellules utilisées pour la technologie In-Fusion® doit être supérieure ou égale à 108 cfu/µg d’ADN.

 

clonage jusqu'à 15 kb avec In-Fusion®

Outils bio-informatiques

Conception des amorces PCR pour le clonage mono-et multi-fragments : « Primer Design Tool »

Calculateur des quantités optimales de vecteur et d’insert à utiliser pour une réaction de clonage In-Fusion® : « Molar Ratio Calculator »

Questions fréquemment posées

Quelle différence y a-t-il entre les formats In-Fusion® et In-Fusion® Plus ?

Les versions Plus contiennent les mêmes éléments que les formats classiques, auxquels se rajoute l’enzyme PCR très haute fidélité Clone Amp HiFi.
Composition des kits In-Fusion® Plus (avec enzyme PCR)

Composition des kits In-Fusion®

Faut-il déphosphoryler le vecteur après digestion par une/des enzymes de restriction en amont de la réaction In-Fusion® ?
Non, la déphosphorylation des extrémités des vecteurs n'est ni requise ni recommandée pour le clonage In Fusion. L'utilisation d'un vecteur déphosphorylé génère un nombre plus faibles de clones, puisque le traitement à la phosphatase alcaline peut modifier les extrémités du vecteur linéarisé et diminuer ainsi l’efficacité de clonage.

Quel nombre maximum de fragments est-il possible de cloner ?
Nous avons cloné avec succès 5 fragments de 1 kb dans un vecteur de 3 kb. En théorie, il n’y a pas vraiment de limite. Cependant l’efficacité de clonage peut diminuer avec le nombre de fragments. Un utilisateur a rapporté qu’il avait réussi à cloner 15 fragments avec le kit In-Fusion®.

Quand puis-je utiliser le Cloning Enhancer ?
Le Cloning Enhancer (CE) est un réactif ajouté directement dans le mix de PCR en fin d’amplification et permet d’éliminer les dNTP et les amorces libres. Il permet de s’affranchir de l’étape de purification sur colonne du produit PCR à condition qu’une bande unique et spécifique soit obtenue. Si le produit PCR est contaminé par des bandes non spécifiques, le produit PCR doit être migré sur gel, la bande découpée puis purifiée sur colonne en amont de la réaction In-Fusion®.

Est-il possible d’ajouter moins ou plus de 15 bases en 5’ des amorces PCR ?
Pour le clonage mono-insert, nous avons testé l’ajout de 10-12 bases ou 20-22 bases en 5’ des amorces et cela peut réduire l’efficacité de clonage. L’ajout de 15 bases donnant des résultats optimaux est donc recommandé.

Pour le clonage multi-inserts, l’ajout de 20 bases donne une meilleure efficacité de clonage.
Voir les résultats dans le poster « Optimized In-Fusion® cloning system »

 

Linéarisation du vecteur : quelles enzymes de restriction sont compatibles avec la technologie In-Fusion® ?
Toutes les enzymes de restriction sont compatibles, celles générant des extrémités 5’ et 3’ sortantes, ainsi que celles donnant des bouts francs.

Quelle est la différence entre les cellules Stellar™ et les DH5 alpha ?
Les cellules Stellar™ sont une espèce différente des DH5 alpha.

Ce sont des cellules E.coli HST08 dont le génotype est F-, endA1, supE44, thi-1, recA1, relA1, gyrA96, phoA, Φ80d lac ZΔ M15, Δ(lacZYA-argF) U169, Δ(mrr-hsdRMS-mrcBC), ΔmrcA, l-

Les cellules DH5 alpha de génotype F– Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK–, mK+) phoA supE44 λ– thi-1 gyrA96 relA1, sont compatibles avec le kit In-Fusion®, mais donnent moins de clones que les cellules Stellar™. Cela peut avoir un impact important pour les clonages difficiles (vecteur « low copy », séquences répétées, clonage multi-inserts). C’est pourquoi, nous recommandons les cellules Stellar™ pour obtenir une efficacité de transformation maximale.

Quelles sont les bactéries compétentes compatibles avec le kit In-Fusion® ?
La compétence des cellules utilisées pour la technologie In-Fusion® doit être au moins de 108 cfu/µg d’ADN.

Les cellules Stellar™, ainsi qu’une majorité de cellules E.coli dédiées au clonage, sont compatibles avec les kits In-Fusion®.

Les cellules Stellar™ ont été validées pour le clonage et l’amplification de vecteurs de taille élevée (par exemple, BAC) et de vecteurs ayant des séquences répétées (LTR des vecteurs rétro- et lenti-viraux et séquences répétées des vecteurs adénoviraux).

Les cellules TOP10 et leurs dérivés (ccdB Survival 2T1R E. coli), ainsi que les souches apparentées (DH10B, MC1061) sont sous-optimales pour le clonage In Fusion, et génèrent un nombre inférieur de clones recombinants. Cela est un problème pour le clonage multi-inserts et lors de l’utilisation d’un vecteur à faible nombre de copies.

Nous ne recommandons pas de transformer les mélanges réactionnels In Fusion avec les bactéries suivantes :

  • Les souches d’E. coli dépourvues des mutations recA1 ou endA
  • Les souches d’E. coli développées pour des applications particulières (par exemple pour l’expression protéique à large échelle)
  • Les souches Gram+
  • Les souches bactériennes portant les mutations nupG (deoR)

Remarque: s'il est absolument nécessaire d'utiliser une souche bactérienne particulière non validée pour le clonage In-Fusion®, une dilution au 1:5 du mélange réactionnel peut augmenter l'efficacité de la transformation.

 

Y a-t-il des optimisations à réaliser dans le cas de vecteurs « low copy » ou avec des séquences répétées (LTR), etc… ?

Pour les vecteurs à faible nombre de copies (1-2 copies/cellule), le clonage In-Fusion® peut être délicat car les nicks ou les gaps des complexes insert(s)/vecteur sont réparés moins rapidement que ceux d’un vecteur se répliquant rapidement.
La présence de nicks ou de gaps peuvent déstabiliser la construction recombinante, en particulier en présence de séquences répétées.
Les cellules compétentes Stellar™ sont déficientes en enzyme de recombinaison et il ne devrait donc pas y avoir de réarrangements des séquences répétées LTR (long terminal repeat sequence) du vecteur lentiviral par exemple.
Cependant, pour éviter des réarrangements indésirables des vecteurs rétro-, lenti- ou adéno-viraux, il est recommandé d'amplifier le vecteur à 30°C et de fixer la vitesse d'agitation à 180 rpm. On peut également effectuer la transformation bactérienne à 30°C.

Autres FAQ

Cloning tips

Le saviez-vous ?

Vrai/faux : la technologie In fusion est une technique de clonage par recombinaison.
Faux : l’enzyme In-Fusion® possède une activité exonucléase qui, lorsque 2 extrémités d’ADN ont une homologie de séquence de 15 bp, libère des extrémités simple brin qui sont par la suite appariées in vitro dans le mix In-Fusion®.
Une fois, la transformation bactérienne réalisée, l’ADN sera réparé et ligué par les enzymes d’E.coli (voir schéma ci-dessous, publié dans (Baogong Zhu et al., In-Fusion® assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques 43:354-359 (September 2007)).

Mécanisme In-Fusion®

Ce mécanisme explique pourquoi il n’est pas possible d’insérer un fragment de PCR sur une région homologue en interne du plasmide, mais seulement à l’endroit où est digéré le vecteur, car l’activité exo fonctionne uniquement sur des extrémités ADN libres.

Vrai/faux : j’obtiens peu de colonies. Pour augmenter le nombre de clones obtenus sur les boites, je dois augmenter le volume de mix In-Fusion® à utiliser pour la transformation des cellules compétentes Stellar™.
Faux : nous recommandons d’utiliser au maximum 5 µl de la réaction de clonage pour 50 µl de bactéries compétentes Stellar™. Si d’autres bactéries que Stellar™ sont utilisées, il est conseillé de diluer la réaction de clonage In-Fusion® en amont de la transformation afin de diminuer le phénomène d’inhibition des cellules compétentes.

Vrai/faux : la technologie In-Fusion® permet aussi de réaliser de la mutagénèse dirigée
Vrai : il est possible de réaliser des substitutions, additions ou délétions avec le même kit que celui utilisé pour les clonages. Un protocole dédié est disponible.
Le logiciel de design des amorces permet de designer simplement les amorces également pour la mutagénèse.

mutagénèse dirigée avec In-Fusion®

Vidéo et tutoriel

Présentation de la technologie In-Fusion®
Comment designer facilement les amorces In-Fusion® pour le clonage et la mutagénèse dirigée ?

Publications

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