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TechOzyme - janvier 2018

Purification des acides nucléiques
COMMENT AMELIORER LA PURETE DES ACIDES NUCLEIQUES ?

L’extraction et la purification des acides nucléiques sont essentielles pour un grand nombre d’études en biologie moléculaire. Le rendement et la pureté des acides nucléiques sont deux éléments importants pour assurer l’efficacité et la fiabilité des analyses. Pour certains échantillons, il est plus difficile d’obtenir un rendement optimal et/ou une pureté satisfaisante.

De nombreuses recommandations pour augmenter le rendement des acides nucléiques avaient été décrites dans le TechOzyme de Juin 2017. Dans ce nouveau TechOzyme, nous passons en revue les différentes techniques de purification et les solutions permettant d’améliorer la pureté des acides nucléiques.

Sommaire

I. Comment et pourquoi purifier les acides nucléiques ?

Il y a quatre étapes principales pour extraire les acides nucléiques
  1. La lyse des cellules
  2. La dénaturation des protéines et des complexes nucléoprotéiques
  3. L’inactivation des nucléases
  4. La purification des acides nucléiques (ADN ou ARN)


Les cellules peuvent être lysées par des méthodes chimiques (à l’aide de détergents comme le CTAB, SDS, etc.) enzymatiques (ex. protéinase K, lysozyme, zymolase, etc.), ou mécaniques (billes de broyage et broyeurs). Ces différentes techniques de lyse ont été décrites dans le TechOzyme de Juin 2017.

Après la lyse, les protéines et les complexes nucléoprotéiques sont dénaturés par des détergents ioniques (ex. SDS), des agents réducteurs (ex. béta-mercaptoéthanol …) ou des agents chaotropes (ex. chlorure de guanidine). La protéinase K peut être également utilisée pour la digestion des protéines.

Les nucléases sont ensuite inactivées par les agents chaotropiques (urée, chlorure de guanidine, thiocyanate de guanidine …) et les chélateurs comme l’EDTA souvent inclus dans les tampons de lyse.

A l’issue des trois premières étapes, les acides nucléiques (ADN et ARN) sont dans un mélange (ou un lysat de cellules) incluant des débris cellulaires, tels que les protéines, les lipides, les polysaccharides, etc. Ces impuretés inhibent généralement les réactions enzymatiques (qPCR, RT-qPCR, séquençage, méthylation, etc). Il est donc essentiel d’éliminer ces impuretés pour obtenir les ADN ou les ARN dans une préparation pure.

II. Les méthodes pour isoler les acides nucléiques

L’isolement des acides nucléiques doit permettre de séparer les ADN ou les ARN des protéines, des débris cellulaires et toutes autres impuretés présentes dans le lysat. Les méthodes de séparation en phase liquide et en phase solide sont deux approches courantes.

a. Séparation en phase liquide

Les solutions organiques ou inorganiques sont utilisées pour isoler sélectivement les ADN ou les ARN. Une étape de précipitation avec de l’alcool et du sel est généralement utilisée après les séparations en phase liquide pour concentrer les acides nucléiques et améliorer leur pureté.

i. Solvant organique (phénol-chloroforme) 

Les ADN sont des molécules chargées négativement en raison des groupements phosphate dans leur squelette. Ils sont insolubles dans les solvants organiques hydrophobes et solubles dans les solutions aqueuses hydrophiles.

Les ADN peuvent être isolés avec un mélange contenant du phénol, du chloroforme et de l’alcool isoamylique (ratio de 25:24:1). Après la centrifugation, les ADN se trouvent dans la phase aqueuse supérieure et sont précipités avec de l’éthanol en présence d’acétate de sodium. Cette méthode douce permet de conserver l’intégrité des ADN et reste une méthode de choix pour isoler des ADN de grande taille (jusqu’à 1 Mbp).  Mais,  les solvants organiques sont toxiques et le protocole est long.

Les ARN peuvent être extraits avec un mélange contenant du phénol, du chloroforme et de l’isothiocyanate de guanidine. Lorsque le pH est acide, les ARN sont dans la phase aqueuse supérieure et les ADN devenant plus solubles sont dans la phase organique inférieure. Les ARN sont ensuite précipités à l’aide d’isopropanol et de chlorure de lithium. L’étape de précipitation peut être remplacée par les colonnes de purification (voir la section II-b séparation en phase solide). Ce mélange reposant sur trois réactifs est également connu sous les noms de TRIzol®, TRI Reagent®… La séparation de phase dans cette méthode est longue et délicate. Et souvent,  les ARN sont contaminés par le phénol après la purification. Le kit Direct-zol RNA est un kit développé par Zymo Research. Il permet de purifier les ARN directement à partir des lysats de TRIzol® sans séparation de phase sur colonnes de purification. Les ARN sont purifiés en quelques minutes et sont ultra-purs, exempts de tous solvants organiques.

La méthode de purification utilisant des solvants organiques est couramment utilisée car la lyse est efficace et les nucléases sont inactivées (car les protéines sont dénaturées par le phénol). Cette approche permet également de  co-purifier les ADN, les ARN et les protéines à partir d’un même échantillon.

ii. Extraction alcaline/SDS 

Les macromolécules comme les protéines, les ADN chromosomiques sont dénaturés en condition alcaline et en présence de SDS, formant des complexes non solubles. Les ADN plasmidiques circulaires ne sont pas dénaturés dans ces conditions et se retrouvent dans le surnageant après la centrifugation. Cette méthode de lyse alcaline est utilisée pour la purification des ADN plasmidiques. De nombreux kits existent et souvent la lyse alcaline est combinée aux colonnes de purification (voir section II-b. séparation en phase solide).


b. Séparation en phase solide 

Les colonnes contenant une matrice de purification sont souvent utilisées pour la séparation des acides nucléiques en phase solide. Le passage des liquides dans la matrice peut se faire par gravité, centrifugation ou filtration sous vide. De nombreux kits commerciaux choisissent cette méthode pour la rapidité et la facilité d’utilisation. La phase solide peut être une résine échangeuse d’ions, une matrice en silice, un gel de filtration ou bien des billes magnétiques de silice ou de verre.

i. Chromatographie échangeuse d’anion 

La méthode est basée sur l’interaction entre les molécules de surface chargées positivement (ex. DEAE : diéthylaminoéthyl cellulose) et les phosphates présents dans les squelettes des acides nucléiques chargés négativement. Les molécules de surface sont fixées à un support solide souvent une résine de billes de silice. Les acides nucléiques se fixent sur les molécules de surface lorsque que la concentration en sel est faible. Les impuretés comme les protéines, les métabolites … sont éliminés par des lavages avec des tampons contenant des concentrations modérées de sel. Les ARN et les ADN peuvent également être éliminés sélectivement en optimisant la concentration en sels et le pH. Les acides nucléiques sont élués dans un tampon à concentration élevée en sel. Une précipitation à l’alcool en présence de sel est généralement recommandée pour concentrer les acides nucléiques après élution.

Cette méthode est ajustable en fonction de la quantité d’acides nucléiques et du nombre d’échantillons. La résine s’adapte à une large gamme de pH (6–9) et de concentration en sels (0,1 – 1,6 M). La pureté des ADN est élevée et comparable à celle de la méthode sur gradient de CsCl (voir section II-c).  Elle permet de purifier des ADN de grande taille jusqu’à 150 kb.

ii. Absorption sur une matrice en silice 

La matrice en silice est capable de fixer sélectivement les ADN en condition de force ionique élevée et en pH ≤ 7. Les impuretés sont éliminées par des lavages et les ADN sont élués dans une solution en force ionique faible et à pH ≥ 7 (ex. le tampon Tris/EDTA ou l’eau distillée). La matrice en silice peut être sous un format de poudre de verre, de particules de verre/silice ou de fibres en verre.

Cette méthode est rapide et simple. Elle permet d’obtenir des ADN purs jusqu’à 30 – 50 kb.

iii. Chromatographie d’exclusion de taille (gel de filtration) 

Cette méthode emploie une matrice poreuse. Les acides nucléiques de haut poids moléculaire sont exclus des pores,  tandis que les petites molécules peuvent pénétrer dans les pores. L’élution des molécules se fait dans l’ordre inverse de leur poids moléculaire (les grandes molécules sont éluées avant les petites). La matrice la plus courante est le Sepharose®, qui est une forme d'agarose réticulée et perlée.

Cette méthode permet de séparer les ADN et les ARN en fonction de leur taille.

iv. Séparation magnétique

La séparation magnétique est simple et efficace. Elle évite les multiples étapes de centrifugation ou de filtration et peut être automatisée facilement.
Les acides nucléiques sont fixés à la surface de particules magnétiques ou paramagnétiques et séparés des impuretés à l’aide d’un aimant. Plus la surface des particules magnétiques est grande, plus le nombre d’acides nucléiques fixés est important. Les billes micro-sphériques sont les meilleurs matériaux en raison de leur surface importante. Les acides nucléiques sont fixés grâce aux ligands présents à la surface des particules magnétiques. Les polymères, les verres poreux, les silices ou bien les particules magnétiques inorganiques (ex. l’oxyde de fer avec une surface modifiée) sont les ligands utilisés.


c. Méthode d’ultracentrifugation en gradient de CsCl 

Les ADN mélangés avec du BEt peuvent être purifiés dans un gradient de densité de CsCl au bout de plusieurs heures d’ultracentrifugation. Les ADN circulaires tels que les plasmides s’accumulent dans la partie où la densité du gradient est faible, car il y a moins de BEt incorporé. Les ADN génomiques linéaires sont dans la partie où la densité du gradient est élevée. Le BEt est éliminé grâce aux solvants hydrophobes et les ADN sont précipités par l’alcool et le sel.

Cette méthode permet d’obtenir des ADN très purs, mais nécessite de disposer d’une ultracentrifugeuse. De plus, le protocole est très long et le BEt est un intercalant cancérigène à manipuler avec précaution.

III. Comment améliorer la pureté des acides nucléiques ?

Après la purification, la pureté des acides nucléiques peut être plus ou moins satisfaisante en fonction de la méthode de purification et du type d’échantillon. Les impuretés les plus courantes ainsi que leur origine sont indiquées dans ce tableau.. Ces impuretés sont souvent des inhibiteurs de réactions enzymatiques. Leur élimination est cruciale pour l’efficacité des applications en aval comme la PCR, la PCR quantitative, le séquençage, etc.

Quelles sont les solutions pour éliminer ces impuretés et comment améliorer la pureté des acides nucléiques ?

a. Elimination des contaminants présents dans les échantillons

La plupart des contaminants provenant des échantillons de départ peut être éliminé efficacement par des méthodes de purification classiques. Mais, il est plus difficile d’éliminer des macromolécules incluant des groupements phénoliques et carboxyliques avec des poids moléculaires variables. Car elles sont solubles dans l’eau comme les acides nucléiques et sont co-purifiées. Les plus connues de ces macromolécules sont des polyphénols, des polysaccharides et des acides humiques qui sont largement présents dans les échantillons environnementaux, comme les sols, les fèces, les plantes mais également les échantillons alimentaires, d’intestins … Plusieurs solutions sont possibles pour les éliminer.

i. La précipitation par CTAB 

Le bromure de céthyltriméthyl ammonium (CTAB) est un détergent ionique qui peut lyser les cellules végétales et former des complexes insolubles avec les acides nucléiques en condition de faible concentration en sel. Les polysaccharides et les polyphénols restant solubles sont éliminés avec le surnageant après la centrifugation.
Cette méthode est fréquemment utilisée pour extraire des acides nucléiques à partir des échantillons de plantes.

ii. Les kits commerciaux 

Les kits séparent efficacement les macromolécules contaminantes des acides nucléiques. Les polyphénols, les acides humiques … peuvent être précipités sélectivement par diminution du pH, car elles deviennent insolubles en pH acide et peuvent être éliminées par la centrifugation.
Les gels d’affinité fixant sélectivement les marcromolécules sont également très efficaces pour éliminer ces contaminants. Le kit OneStep PCR Inhibitor Removal kit est basé sur le principe d’un gel d’affinité fixant les contaminants. Leur élimination se fait rapidement après une seule centrifugation. Ce kit permet également d’éliminer les mélanines, les tanins, les acides fluviques, etc.


b. Elimination des contaminants issus des tampons ou des réactions enzymatiques

Après la purification, les impuretés comme le phénol (méthode d’extraction phénol/chloroforme), les sels, les détergents peuvent être encore présents. La méthode de purification en phase solide est généralement utilisée pour nettoyer les acides nucléiques. Les colonnes de purification par centrifugation sont les plus utilisées pour ce type de nettoyage, car pratiques et rapides. Mais, les colonnes de purification conventionnelles sont connues pour générer des contaminations de transfert (carry-over contaminations). Ces contaminations proviennent des gouttes de tampon retenues à la surface de la colonne malgré les centrifugations. Pour minimiser ces contaminations de transfert, des centrifugations supplémentaires sont recommandées et il est nécessaire d’éluer les acides nucléiques dans un grand volume de tampon. Mais, pour des applications sensibles comme la qPCR et le séquençage, toutes les traces d’impureté persistantes sont néfastes.

Les colonnes Zymo-Spin™ (Zymo Research) dont la forme a été revisitée ne laissent aucun tampon résiduel à la surface des matrices (figure 1. Zymo-Spin Technology). Grâce à cette nouvelle conception de colonne, il est possible d’obtenir des acides nucléiques ultra-purs et en même temps de réduire le volume d’élution jusqu’à 6 µl. Ces colonnes permettent non seulement de purifier mais, également de concentrer les acides nucléiques.

Les colonnes Zymo-Spin™ sont également excellentes pour purifier les acides nucléiques à partir de réactions enzymatiques (ex. PCR, digestions enzymatiques, In-vitro transcription, ChiP, séquençage...). Les acides nucléiques sont exempts de toutes impuretés comme les enzymes, les nucléotides, les sels … et sont plus concentrés qu'au départ grâce au volume d’élution réduit (kits DNA Clean & Concentrator  & RNA Clean & Concentrator)..


IV. Comment analyser/quantifier les acides nucléiques après la purification ?

Les ADN (double brin, simple brin, oligo) ou les ARN purifiés peuvent être quantifiés par les spectrophotomètres comme le NanoDrop™ ou les fluorimètres.

Contrairement, à la fluorimétrie, la pureté des acides nucléiques est très bien analysée par le spectrophotométre NanoDrop™
.
Les méthodes d’analyse des acides nucléiques sont décrites dans le TechOzyme de Septembre 2016.



V. Questions fréquemment posées

a. Je travaille avec des échantillons de plante, riches en polyphénols et polysaccharides. Quelles sont les solutions pour purifier efficacement les ADN ?

Le kit Quick-DNA Plant/Seed peut efficacement éliminer ces contaminants grâce aux colonnes de purification incluses.
Si vous avez déjà purifié les ADN avec une autre méthode, vous pouvez utiliser le kit OneStep PCR Inhibitor Removal (Zymo Research) qui élimine les polyphénols en combinaison avec le kit genomic DNA Clean & Concentrator (Zymo Research) éliminant les polysaccharides.

b. J’ai très peu d’ADN après purification et je veux faire un nettoyage supplémentaire. Est-ce que je peux faire un « clean-up » ? 

Oui. Le kit DNA Clean & Concentrator-5 permet de purifier des ADN dont la quantité est < 1 ng.

 

VI. Le saviez-vous ?

Si vous observez que vos ADN sont dégradés sur un gel d’agarose après la purification, il est possible que ce soit à cause de l’acidification du tampon de charge. En effet, les micro-organismes peuvent pousser facilement dans les tampons de charge concentrés (6x ou 10x) riches en source de carbone (sucrose, glycérol, etc. …). La croissance microbienne peut acidifier le tampon. Il est recommandé d’ajouter 1 mM d’EDTA dans les tampons de charge pour prévenir la croissance microbienne et son acidification et d’utiliser des tampons de charge fraîchement préparés.

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