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TechOzyme - avril 2018

Dosage d’analytes : ELISA en sandwich
Les conseils pour bien choisir son kit ELISA

Kits ELISA, détection de cytokines secrétées

L’ELISA ou « Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay » est une technique immuno-enzymatique sur support solide pour détecter et quantifier la présence d'un analyte dans un échantillon. L’analyte peut être une cytokine soluble, une chimiokine, un facteur de croissance ou même une hormone présente à de très faibles concentrations (du nanogramme au picogramme/ml) dans du plasma, du sérum, des surnageants de culture cellulaire ou dans d’autres fluides biologiques. L’ELISA repose sur le principe de fixation spécifique d’un anticorps à un antigène. C’est une technique hautement sensible et spécifique, fiable et reproductible.

Dans ce TechOzyme, après une brève présentation de l’ELISA dit en sandwich et de ses avantages, nous décrivons les différents formats d’ELISA en sandwich et les critères pour choisir de façon appropriée le format de son kit. Nous expliquons également la signification des données techniques fournies avec les kits ELISA, données liées à la validation des kits. Nous terminons par une présentation du dosage en multiplex pour détecter simultanément plusieurs analytes.

Sommaire

I. L’ELISA en sandwich et ses avantages

La technique d'ELISA a été conceptualisée et développée par 2 scientifiques suédois, Peter Perlmann et Eva Engvall à l'Université de Stockholm en 1971.

Le principe de cette technique immuno-enzymatique de détection est simple. Il s’agit de visualiser une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction enzymatique colorimétrique. L’enzyme, préalablement fixée à l’anticorps, catalyse une réaction chimique qui transforme son substrat en composé coloré.

L'utilisation d'anticorps monoclonaux rend la détection plus  sensible et spécifique et il est possible de quantifier les analytes dosés grâce à la réalisation d'une gamme étalon (en concentration) en parallèle.

L’ELISA en sandwich consiste à isoler une protéine, que l’on cherche à doser, entre deux anticorps dirigés contre elle mais reconnaissant des épitopes différents.

En détail :
  • Les puits d’une plaque sont coatés avec un anticorps de capture de quantité connue.
  • L'échantillon contenant l’antigène à doser est ajouté et tout antigène présent se lie à l'anticorps de capture.
  • La plaque est rincée pour éliminer tout antigène non lié.
  • Un anticorps de détection (anticorps primaire) est ajouté et se lie à l'antigène.


Si l’anticorps de détection est directement couplé à une enzyme (biotine), on parle d’ELISA Sandwich direct.
Si l’anticorps de détection n’est pas conjugué, on utilise un second anticorps de détection (anticorps secondaire couplé biotine) et on parle alors d’ELISA Sandwich indirect (cf. schéma ci-dessous).
On incube ensuite avec de la streptavidine-HRP. Puis, le substrat de l’HRP (Horse Radish Perxoxydase) est ajouté et converti en un produit détectable en lecture de DO.

ELISA sandwich workflow

Les anticorps de capture et de détection doivent être correctement choisis pour éviter toute cross-réactivité et compétition au niveau des sites de liaison de l’antigène.

Les avantages des kits ELISA en Sandwich :

  • Une haute spécificité car 2 anticorps sont utilisés pour capturer et détecter spécifiquement l’antigène (ou analyte) à doser
  • Une haute flexibilité et sensibilité car des méthodes de détection directe et indirecte peuvent être utilisées
  • Une adaptabilité de ces kits y compris avec des échantillons complexes, puisque l’antigène ne nécessite aucune purification avant son dosage

II. Les différents types de kit ELISA en sandwich

Il existe 3 formats différents d’ELISA en fonction de leur composition. Du plus basique au plus complet :

- Les kits dits standard contenant uniquement les anticorps de capture et de détection pré-titrés, l’avidine-HRP et une protéine recombinante pour réaliser la courbe étalon. Il s’agit par exemple des kits ELISA MAX™ Standard de BioLegend.
Consulter la liste des kits ELISA MAX™ Standard

- Les kits que l’on peut appeler intermédiaires qui contiennent tous les éléments des kits standards mais aussi des microplaques, des tampons (tampon de dilution, tampon pour coater les plaques) et le substrat TMB. BioLegend propose les kits ELISA MAX™ Deluxe.
Consulter la liste des ELISA MAX™ Deluxe

- Les kits dits prêts à l’emploi composés de plaques directement pré-coatées avec l’anticorps de capture et l’ensemble des réactifs dont les tampons nécessaires à la réalisation du dosage ELISA. Parmi ces kits, les ELISA Genie et les LEGEND™ MAX Elisa.
En savoir plus sur les kits ELISA Genie
Consulter la liste des LEGEND™ MAX Elisa

Consulter la liste des PathScan® Sandwich ELISA

 


Les tests ELISA génèrent 3 types de données :


- Qualitatives : les tests ELISA peuvent être utilisés pour obtenir une réponse OUI/NON indiquant si un antigène particulier est présent ou pas dans un échantillon, en comparant avec un puits blanc ne contenant pas d’antigène (contrôle négatif)

- Semi-quantitatives : il est possible de comparer les taux relatifs d’un antigène dans des échantillons, puisque l’intensité du signal est directement corrélée à la concentration de l’antigène

- Quantitatives : les données sont comparées avec une courbe standard / étalon (réalisée avec des dilutions en série d’un antigène ou d’une protéine recombinante donnée) pour calculer précisément les concentrations de l’antigène étudié dans divers échantillons

III. Les critères pour choisir son kit ELISA en sandwich

Il convient dans un 1er temps de choisir son kit ELISA en fonction de la cible à doser et de l’espèce étudiée, homme, souris, rat, voire des espèces moins courantes comme le chien, le porc, …

D’autres paramètres rentrent en compte comme le temps à allouer à la manipulation, le niveau de familiarisation avec la technologie ELISA et le budget disponible.

Les 3 formats présentés plus haut (chapitre II) répondent à ces paramètres.

En effet, les chercheurs novices dans le domaine de l’ELISA ou bien ceux maîtrisant la technique mais disposant de peu de temps choisiront le format prêt à l’emploi LEGEND MAX™. Les kits LEGEND MAX™ fournissent des résultats rapides et fiables.

Le format ELISA MAX™ Deluxe représente une alternative économique, avec des résultats rapides pour des utilisateurs peu expérimentés.

Enfin, les ELISA MAX™ Standard sont plutôt destinés aux chercheurs aguerris avec la technique et à ceux souhaitant une version très économique. Ces chercheurs devront fournir leurs plaques et les coater eux-mêmes avec l’anticorps de capture.

Quel format de kit ELISA dois-je choisir ?
En complément des différents critères précédemment mentionnés, les données de validation des kits ELISA fournies avec chaque kit peuvent aider l’expérimentateur dans son choix. Ces différentes spécificités techniques des kits ELISA sont détaillées dans la rubrique ci-dessous.

IV. Signification des données techniques fournies avec les kits ELISA

a. Courbe standard, Sensibilité et Gamme de détection

Généralement, les kits ELISA commerciaux sont fournis avec ces 3 données :

- Courbe standard : pour chaque lot de kit ELISA, des séries de dilutions sont réalisées à partir d’une protéine recombinante standard pour réaliser la courbe standard idéale. Celle-ci doit être linéaire pour être correcte.

- Sensibilité : elle indique la limite de détection et de quantification. Elle donne le niveau le plus bas de l’analyte qui peut être dosé et distinct du bruit de fond. Cette donnée fournie avec chaque kit ELISA est indispensable pour s’assurer que le kit convient bien à la détection de sa cible d’intérêt qui peut être en quantité très faible dans ses échantillons.

-  Gamme de détection ou Gamme dynamique : il représente les concentrations maximale et minimale de l’analyte ciblé que le test peut quantifier précisément. Cette gamme dynamique s’étend du plus bas point au point le plus élevé de la courbe standard. Elle est comprise entre quelques pg/ml et quelques ng/ml. Pour les cibles qui sont abondantes dans un échantillon biologique, celui-ci devra être dilué au préalable pour que le signal brut de l’échantillon entre dans la gamme de détection du test.

Exemple avec le kit Human IL-10 avec une sensibilité < 4.688 pg/ml et une gamme dynamique comprise entre 7.813 et 500 pg/ml


b. Précision ou % CV

La précision de l’ELISA est définie sur la base de la reproductibilité des résultats au sein d’un test et entre plusieurs tests. Cette caractéristique est extrêmement importante pour s’assurer que les résultats obtenus au cours d’une étude sont fiables et reproductibles d’une expérience à l’autre.

La précision est mesurée sous la forme d’un coefficient de variation (CV) exprimé en % à partir de la valeur moyenne.

Deux types de précision sont à considérer, la précision intra-essai et la précision inter-essai :

- La 1ère représente la reproductibilité entre les puits d’une même plaque. Cela permet à l’expérimentateur de faire plusieurs « réplicats » d’un même échantillon dans différents puits d’une même plaque et d’obtenir des résultats similaires.

- La seconde correspond à la reproductibilité entre plusieurs essais. Elle garantit que les résultats observés seront reproductibles quand plusieurs kits/plaques sont utilisés au fil du temps.

Un % de CV inter-essai inférieur ou égal à 15 % est généralement acceptable. Le % de CV intra-essai doit être quant à lui inférieur ou égal à 10 %.

Exemple avec le kit Human IL-8
Intra-Assay : CV < 8 %
Inter-Assay : CV < 10 %


c. Linéarité et « Spike-Recovery »

Ces 2 données sont représentatives de la précision du test et permettent de voir si un élément dans l’échantillon peut interférer avec le dosage.

- Linéarité de la dilution : elle est corrélée à la précision de l’ELISA et à sa compatibilité avec l’échantillon analysé. Elle identifie quelle concentration de l’échantillon biologique est compatible avec le test et aussi la gamme linéaire du test pour cet échantillon c'est-à-dire la gamme dans laquelle le signal détecté est directement proportionnel à la concentration de l’analyte mesuré.

Elle est déterminée en supplémentant l’échantillon avec une concentration connue d’une protéine cible recombinante (contrôle positif pour l’ELISA), puis en réalisant des dilutions en série. Le test ELISA permet ensuite de déterminer la concentration de la protéine en se référant à la courbe standard. La linéarité est définie par rapport à la quantité d’analyte calculée sur la base de la courbe standard. La concentration calculée finale de l’analyte dans un échantillon doit être la même pour n’importe quelle dilution présente dans la gamme dynamique du test.  
La linéarité est donnée sous la forme d’un %. Elle est considérée comme faible si elle est inférieure à 80 % ou supérieure à 120 % et cela signifie que les diluants de l’échantillon (et/ou du standard) ou l’échantillon lui-même interfèrent avec la détection de l’analyte. La linéarité est importante pour une mesure précise de la concentration en analyte sur l’ensemble de la gamme dynamique de l'essai.

- Spike-Recovery : cette donnée détermine si la détection de l’analyte est affectée par la composition des échantillons.

A titre d’exemple, des échantillons comme du sérum ou du plasma peuvent contenir des facteurs (type EDTA, héparine) qui empêchent une quantification précise de l’analyte en interférant au niveau de la liaison antigène-anticorps. Au niveau du dosage, cela se traduit par un signal plus ou moins fort.
Comment cette donnée est-elle déterminée ? Des quantités connues de l’analyte sont ajoutées dans différents types d’échantillons (sérum, plasma avec de l’EDTA, plasma avec de l’héparine, …). Le test ELISA est réalisé et la concentration de l’analyte est déterminée grâce à la courbe standard réalisée en parallèle. Le spike-recovery correspond à la différence entre la concentration observée et celle attendue. Il est représenté sous forme d’un % qui doit être compris entre 80 et 120 % pour qu’un kit soit fiable et adapté à la quantification de son analyte d’intérêt.

Exemples de Spike-Recovery et de Linéarité avec le kit Human IL-10

Spike-Recovery pour l’ELISA Human IL-10
Linéarité de dilution pour l’ELISA Human IL-10

V. Le dosage en multiplex

a. Descriptif

Le dosage immunologique en multiplex est basé sur la capacité d’un cytomètre à détecter finement différents niveaux de fluorescence et sur l’utilisation de billes couplées à des anticorps qui capturent spécifiquement différents analytes (cytokines par exemple). Chaque bille du dosage possède une intensité de fluorescence unique, ce qui permet de mélanger et d’enregistrer différentes billes en même temps dans un même tube. A la différence de l’ELISA qui permet de quantifier une seule cytokine à la fois, le dosage en multiplex peut quantifier de multiples cytokines simultanément à partir d’un même échantillon. Le multiplexage est aussi particulièrement utile quand la quantité d’échantillon est faible, en analysant plusieurs protéines simultanément. Chaque essai est composé d’une paire d’anticorps qui est évaluée pour sa gamme dynamique et sa sensibilité. Les anticorps de détection sont directement marqués à la phycoérythrine (PE). La méthode de détection streptavidin-biotin-PE n’est pas utilisée pour ce type de dosage, ce qui permet de minimiser le bruit de fond souvent généré par la biotine endogène dans les échantillons. La technologie s’appelle LEGENDplex™ chez BioLegend.



b. Les différents formats existants chez BioLegend


- Les kits ou panels prédéfinis (panels LEGENDplex™) : prêts à l’emploi, ils sont configurés par domaines fonctionnels (par exemple, panel Th1/Th2, panel inflammation, panel cytokine, …). Ils contiennent les billes de capture, les anticorps de détection, les tampons et un standard. Chacun de ces composants a été pré-optimisé pour être plus simple d’utilisation et donner des résultats rapides et cohérents, facilement analysables et reproductibles. Ainsi, les tampons ont été spécifiquement formulés pour réduire les effets délétères des protéines plasmatiques ou sériques sur la performance du test.

 

- Les combinaisons des spécificités à partir d’un panel prédéfini (système LEGENDplex™ Mix and Match) : elles offrent plus de flexibilité et représentent une méthode de détection ouverte et configurable, permettant aux chercheurs d’établir leurs propres tests multiplex. Les spécificités disponibles incluent des cytokines et des chimiokines, de différentes espèces (homme, souris, rat, …). Jusqu’à 13 analytes différents peuvent être analysés simultanément. Quand un chercheur opte pour ce format, il doit commander séparément les différents éléments. Dans un 1er temps, il choisit les analytes ou cytokines qu’il souhaite mesurer et sélectionne les billes de capture correspondantes. Puis, il doit ajouter le cocktail de standard, les anticorps de détection et l’ensemble des tampons.

- Les kits à façon (LEGENDplex™ Custom Panels) : solution permettant de détecter des analytes impliqués dans différentes voies (réponse immunitaire et métabolisme par exemple) qui n’ont pas les mêmes anticorps de détection ou standard ou des cibles qui n’existent pas encore au catalogue.



c. Avantages du dosage multiplex

Le volume d’échantillon requis par test est moindre par rapport à l’ELISA. De ce fait, le dosage de plusieurs cytokines est tout de même possible à partir de faibles quantités de matériel biologique.
Le temps nécessaire à l’obtention des résultats est réduit par rapport à la technique de référence ELISA.

En savoir plus sur la technologie LEGENDplex™

 

VI. Questions fréquemment posées

a. Pour faire mon ELISA, est-il possible de mélanger les composants provenant de différents fournisseurs ?

Non, ce n’est pas recommandé car les performances du test ELISA seront affectées. Les anticorps diffèrent entre les fournisseurs de par leur spécificité et c’est cette même spécificité qui va dicter comment le signal sera détecté en ELISA. Les standards fournis par les différents fournisseurs peuvent aussi être différents. En effet, il s’agit de protéines recombinantes exprimées et purifiées selon des méthodes différentes selon les fournisseurs et peuvent présenter une immunoréactivité variable selon les lots.
 

b. Est-il possible de faire un ELISA avec des échantillons de tissus ?

Les ELISA sont compatibles avec des homogénats/extraits de tissus/cellules si ces derniers respectent les critères ci-dessous :

- Sont issus d’une lyse ou d’une homogénéisation réalisée dans un tampon de pH neutre qui ne contient aucun agent chimique dénaturant comme de l’urée, thiourée ou SDS

- Sont exempts ou présentent un taux minimum de détergents (SDS, Triton X-100, …) dans les tampons utilisés

- Ne présentent aucune force ionique excessive (concentration de sel supérieure à la force ionique physiologique).

Les tampons doivent contenir des inhibiteurs de protéases en quantité suffisante pour préserver les protéines cibles de toute dégradation protéolytique par les enzymes libérées des cellules.
 

c. A quelles étapes peut-on stopper son test ELISA en cours ?

Les plaques peuvent être coatées avec l’anticorps de capture toute la nuit à 4°C et ensuite être stockées à 4°C pendant 1 à 2 jours supplémentaires.
Quant à l’étape de blocage, les plaques peuvent être conservées avec le tampon de blocage toute la nuit ou 1 à 2 jours à condition d’être scellées à l’aide d’un film protecteur. De manière générale, les plaques ne doivent jamais sécher. Il convient de noter qu’un stockage prolongé des plaques après « coating » avec l’anticorps de capture avant leur utilisation peut éventuellement conduire à une augmentation du signal issu du bruit de fond.

 

 

VII. Le saviez-vous ?

a. Pourquoi l’utilisation d’azide dans les tampons n’est-elle pas recommandée ? 

Car, l’azide est un inhibiteur irréversible de l’HRP.

b. Les concentrations recommandées pour les anticorps coatés au fond des plaques et de détection

 

Concentrations recommandées des anticorps de capture et de détection
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